73固定相與流動相講義課件

第七章

高效液相色譜分析法7.3.1

液相色譜固定相7.3.2液相色譜流動相第三節(jié)

液相色譜的固定相與流動相Highperformanceliquidchromatograph,HPLCStationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/11/277.3.1液相色譜固定相

1.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔(dān)體

氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見。現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料。（2）表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量低。2023/11/27（3）化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相：應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相。

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水，耐光，耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣。

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/11/27化學(xué)鍵合固定相的特點：（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷。（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定。（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性。（5）有利于梯度洗脫。存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主。

2023/11/272.液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。種類有限，應(yīng)用面相對較窄。結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm。

2023/11/273.離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂。（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）。

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）。（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）。2023/11/274.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠。非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性好，機(jī)械強(qiáng)度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶?，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2023/11/27

５.手性固定相生物、藥物分子和天然有機(jī)產(chǎn)物的分離。環(huán)糊精（CD）結(jié)構(gòu)：2023/11/27環(huán)糊精：

空腔內(nèi)壁為弱疏水性，所有羥基在空腔的外沿呈親水性，這使它們能與各種極性、非極性分子、離子形成包含化合物（主客體配合物）。

1984年Armstrong首次將環(huán)糊精鍵合到二氧化硅上用作HPLC的手性分離固定相，目前已成為十分普及的手性固定相。全苯基環(huán)糊精分離柱特別適合于分離氨基醇類β阻斷劑，而其他類型手性固定相則很難分離。2023/11/277.3.2液相色譜的流動相1.流動相特性（1）流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，正相，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/11/272.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2023/11/273.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。

采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。

也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/11/27多元混合溶劑的溶劑極性參數(shù)計算

式中

i為混合溶劑中各溶劑的體積百分?jǐn)?shù)。二元混合溶劑的則為式中

A，

B分別為二元混合溶劑中溶劑A和溶劑B的體積百分?jǐn)?shù)。

2023/11/27多元混合溶劑的溶劑極性參數(shù)計算

色譜分析需要調(diào)節(jié)流動相極性使試樣組分的容量因子k的數(shù)值在適宜范圍內(nèi)。對于正相色譜，二元溶劑的極性參數(shù)P'和組分的k值存在如下關(guān)系：

式中、分別為初始和調(diào)節(jié)后二元溶劑的極性參數(shù)。k1、k2為組分相應(yīng)的容量因子。2023/11/27例4-3在一反相色譜柱上，當(dāng)流動相為30%甲醇和70%水(體積比)時，某組分的保留時間為25.6min，死時間為0.35min，如何調(diào)節(jié)溶劑配比使組分容量因子為5？

解：初始值

=0.75

即調(diào)整溶劑比例為75%甲醇和25%水可使該組分的k值為5。2023/11/27溶劑的選擇性溶劑和樣品分子間的作用力用接受質(zhì)子的能力xe、給予質(zhì)子的能力xd和靜電力xn(由偶極矩決定)三種參數(shù)來表征，并以xe、xd和xn構(gòu)成一個三角坐標(biāo)圖

。

溶劑可分為八組而分別位于圖中不同區(qū)。I組的xe值較大，屬質(zhì)子受體溶劑；VII組的xd值較大，屬質(zhì)子給于體溶劑；V組的xn值較大，屬偶極作用力溶劑。同組溶劑在分離中具有相似的選擇性，不同組差別較大。2023/11/27溶劑的選擇性2023/11/274.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積，損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足