絲裂原活化蛋白激酶mapk在不同年齡小鼠卵母細(xì)胞中的表達(dá)及其與紡錘體和染色體構(gòu)象的關(guān)系

絲裂原活化蛋白激酶mapk在不同年齡小鼠卵母細(xì)胞中的表達(dá)及其與紡錘體和染色體構(gòu)象的關(guān)系

錯誤的卵圓和體組織與母體時代之間的相關(guān)性尚不清楚。有研究認(rèn)為,在老齡個體的卵母細(xì)胞中,形成正常紡錘體所需的某些調(diào)控因子可能發(fā)生改變,從而引起卵母細(xì)胞紡錘體和染色體構(gòu)象異常。絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)MAPK-1(P44ERK1)和MAPK-2(P42ERK2)是調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的關(guān)鍵分子,在多種動物卵母細(xì)胞(包括小鼠、大鼠、豬、羊等)的成熟分裂中發(fā)揮作用,可誘導(dǎo)不同動物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的啟動,或參與減數(shù)分裂后續(xù)事件的調(diào)控。對豬卵母細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),在體外老化的豬卵母細(xì)胞中,MAPK的活性隨紡錘體和染色體構(gòu)象異常率增加而顯著降低,提示MAPK對于維持微管和染色體在減數(shù)分裂中的正常行為具有重要作用。鑒于MAPK在老化卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中對于維持微管和染色體正常行為的重要作用,我們推測,MAPK也可能與高齡女性卵母細(xì)胞紡錘體和染色體構(gòu)象異常有關(guān)。為了解答這一問題,本研究以小鼠卵母細(xì)胞作為研究對象,采用免疫細(xì)胞化學(xué)與激光共聚焦顯微術(shù)相結(jié)合的方法檢測了MAPK(ERK1/2)在不同年齡小鼠卵母細(xì)胞中的活性表達(dá)。數(shù)據(jù)和方法1.透明質(zhì)酸酶激活劑genussp.k-ra實驗動物為6～8和45～50周齡的雌性中國昆明小白鼠(購自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動物研究所)。小鼠飼養(yǎng)采用自由采食、飲水、人工控溫(22～26℃)和控光(14h光照,10h黑暗)。腹腔內(nèi)注射孕馬血清促性腺激素(PMSG,10IU/只),46～48h后腹腔內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(hCG,10IU/只),14～18h后頸椎脫臼法處死小鼠,取出輸卵管,置于含Gamete培養(yǎng)液(瑞典Vitrolife公司)的培養(yǎng)皿中,撕破輸卵管壺腹,收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulusoocytecomplexesCOC),在含80IU/ml透明質(zhì)酸酶(美國Sigma公司)的Gamete液中輕輕吹打3～5min,脫去顆粒細(xì)胞,移入IVFTM～30(瑞典Vitrolife公司)培養(yǎng)液中,放入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)后2h收集處于MⅡ的成熟小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)。2.離體卵母細(xì)胞的制備紡錘體和染色體構(gòu)象的免疫細(xì)胞化學(xué)參照Pickering等的方法進(jìn)行。將小鼠卵母細(xì)胞移入2%甲醛和0.02%TritonX～100混合液中,37℃固定和透化胞膜30min。用含0.3%小牛血清白蛋白(BSA)的磷酸緩沖液(PBS)作為清洗液洗3次,放入加有0.5%胎牛血清的α微管蛋白單克隆抗體(購自武漢博士德公司),工作濃度為1∶100,37℃孵育45min或4℃過夜。清洗液洗3次后,將卵母細(xì)胞移入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自北京中山生物技術(shù)有限公司)中,工作濃度為1∶100,37℃避光孵育45min,清洗液洗3次,以去除未結(jié)合的抗體。最后將卵母細(xì)胞移入50μg/ml碘化丙啶(PI,美國Sigma公司)中復(fù)染15min,整裝壓片,在激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)下觀察紡錘體和染色體形態(tài)分布并攝片。卵母細(xì)胞ERK1/2蛋白的表達(dá)參照Fan等的方法進(jìn)行。將小鼠卵母細(xì)胞移入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中,37℃固定30min,而后放入0.5%TritonX-100中透化胞膜30min。用含0.3%BSA的PBS(清洗液)洗3次,放入磷酸化ERK1/2單克隆抗體(購自北京中杉金橋公司),工作濃度為1∶50,4℃過夜。清洗液洗3次后,將卵母細(xì)胞移入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(購自北京中山生物技術(shù)有限公司)中,工作濃度為1∶100,37℃避光孵育45min,清洗液洗3次,以去除未結(jié)合的抗體。在激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)下觀察ERK1/2的表達(dá)并測定ERK1/2蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)度。3.錘體染色異常紡錘體和染色體構(gòu)象的評估參照Boisoetal的標(biāo)準(zhǔn)。正常情況下,紡錘體為兩極對稱的桶形,染色體緊密排列在赤道板上。紡錘體異常包括:兩極距離縮短、極性異常、極性完全消失或缺如;染色體構(gòu)象異常包括:個別染色體從赤道板上脫落、染色體失去正常的緊密排列結(jié)構(gòu)、松散分布、凝結(jié)成塊、模糊不清或缺如。4.統(tǒng)計方法計數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗,計量數(shù)據(jù)采用配對t檢驗,以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1.小鼠卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體檢查結(jié)果共檢測54個年齡6～8周小鼠卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體,其中正常紡錘體和染色體49個(91%),異常紡錘體和染色體5個,占9%。在檢測的42個45～50周小鼠卵母細(xì)胞中,正常紡錘體和染色體為30個(71%),明顯低于6～8周小鼠;異常紡錘體和染色體12個(29%),明顯高于6～8周小鼠(P<0.025)(表1)。2.卵母細(xì)胞熒光強(qiáng)度ERK1/2在卵母細(xì)胞中沿紡錘體分布,在整個紡錘體上都有ERK1/2的表達(dá)。將小鼠卵母細(xì)胞按母體年齡分為兩組(6-8周組和45-50周組),每組各測定20個卵母細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。6-8周組卵母細(xì)胞的ERK1/2熒光強(qiáng)度為78.21±13.34;45-50周組卵母細(xì)胞的ERK1/2熒光強(qiáng)度為61.45±15.67,前者明顯高于后者(P<0.05)。mapk在紡錘體和染色體構(gòu)象異常中的活性紡錘體是由大量微管縱向排列組成的中間寬、兩極小的細(xì)胞器,對于卵母細(xì)胞染色體的平衡、運(yùn)動、分離和極體的排出具有重要作用。在分裂中期,兩極的紡錘體微管分別同染色體的兩個動粒(kinetochore)結(jié)合,裝配形成染色體牽絲,在其作用下,染色體逐漸移向紡錘體的中心區(qū),形成紡錘體赤道板。在分裂后期,染色體的動粒在染色體牽絲的作用下發(fā)生斷裂,引起同源染色體或姐妹染色單體分離,分別移向兩極。因此,正常的紡錘體和染色體構(gòu)象是確保減數(shù)分裂正常進(jìn)行和染色體正確分離的關(guān)鍵之一。Tarin等對小鼠卵母細(xì)胞的研究結(jié)果顯示,高齡小鼠(40周)卵母細(xì)胞染色體構(gòu)象異常率顯著高于幼年小鼠(10～12周),而且前者卵母細(xì)胞的非整倍體發(fā)生率也明顯高于后者。本組資料中6～8周小鼠卵母細(xì)胞紡錘體和染色體構(gòu)象異常率顯著低于45～50周小鼠,與Tarin等的結(jié)果一致。關(guān)于老齡小鼠卵母細(xì)胞中紡錘體和染色體構(gòu)象異常率增高的原因至今尚未弄清,推測可能與卵母細(xì)胞中某些調(diào)控因子活性下降或失去作用有關(guān)。MAPK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,又被稱為細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellularregulatedkinase,ERK),是激素、生長因子、細(xì)胞因子和環(huán)境刺激等細(xì)胞外信號的中間傳導(dǎo)物。MAPK在體細(xì)胞中廣泛表達(dá),通過其信號級聯(lián)(MAPKKK/MAPKK/MAPK)將不同的細(xì)胞外信號傳遞至細(xì)胞核內(nèi),從而調(diào)控細(xì)胞周期。在生發(fā)泡期(germinalvesicleGV期)卵母細(xì)胞中MAPK以無活性形式存在,生發(fā)泡破裂(germinalvesiclebreakdownGVBD)之后被磷酸化激活,其活性在MⅠ期達(dá)頂峰并維持至MⅡ期。MAPK在空間上的分布與微管和染色質(zhì)行為密切相關(guān),本研究中,MAPK沿紡錘體的分布也證實了這一點。GVBD之后,MAPK參與了卵母細(xì)胞紡錘體的組裝和維持染色體的正常排列。在豬卵母細(xì)胞體外老化過程中,MAPK的活性明顯下降,這被認(rèn)為是引起卵母細(xì)胞體外老化后紡錘體和染色體構(gòu)象異常率顯著增高的主要原因之一。目前關(guān)于MAPK在卵母細(xì)胞中的表達(dá)與母體年齡的關(guān)系尚未見報道。本研究以小鼠卵母細(xì)胞為研究對象,檢測了MAPK在不同年齡小鼠卵母細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示,高齡小鼠(45～50周)卵母細(xì)胞中的ERK1/2蛋白表達(dá)明顯低于幼齡小鼠(6～8周)。MAPK是組成卵母細(xì)胞微管組織中心的功能成分之一,高水平的MAPK對于維持染色體的正常構(gòu)象至關(guān)重要,其活性下降可導(dǎo)致微管組織中心功能改變和微管重構(gòu),切斷紡錘體和染色體間的正常聯(lián)系,引起染色體的排列不穩(wěn)定。因此,MAPK的活性下降很可能是造成高齡小鼠卵母細(xì)胞紡錘體和染色體構(gòu)象異常的重要原因之一。MAPK在減數(shù)分裂的調(diào)節(jié)中具有重要作用,它不僅是紡錘體的調(diào)控因子,而且是一種紡錘體監(jiān)控點蛋白(spindlecheckpointprotein)。紡錘體監(jiān)控點功能在于監(jiān)控細(xì)胞分裂中期紡錘體的完整性和染色體的排列,只有當(dāng)所有的染色體動粒都與一個或更多的紡錘體微管相連,所有的染色體都定位于赤道板上時,減數(shù)分裂才會從中期進(jìn)入后期,否則減數(shù)分裂停滯,直到錯誤解除。因此,MAPK在高齡小鼠卵母細(xì)胞中的表達(dá)下降也提示,高齡個體卵母細(xì)胞紡錘體監(jiān)控點的功能