地黃不同炮制品對(duì)糖尿病大鼠降糖作用的影響

地黃不同炮制品對(duì)糖尿病大鼠降糖作用的影響

增液湯是吳茱通在《溫病條約》中記錄的一個(gè)例子，它有助于降低血糖。鑒于地黃有鮮地、生地和熟地之分,因加工炮制方法不同,其化學(xué)成分及其含量則有所不同,推測(cè)地黃不同炮制品的組方藥效亦可能存在差別。地黃生熟異用后增液湯降血糖作用是否有變化?目前尚未見到報(bào)道。本文首次將地黃不同炮制品納入增液湯中進(jìn)行地黃在復(fù)方中降血糖作用對(duì)比研究,旨在揭示地黃生熟異用對(duì)增液湯降血糖作用的區(qū)別,研究鮮地黃、生地黃和熟地黃降糖功效的差異,指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥。鮮地-增液湯、生地黃、鮮單一克氏原試劑ss1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠,清潔級(jí),體質(zhì)量180-220g,由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(豫)2010-0002,合格證號(hào):0008680。2.實(shí)驗(yàn)儀器UV-3200紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);BMG型多功能酶標(biāo)儀(江蘇萬(wàn)科科教儀器有限公司)。3.藥品與試劑鏈脲佐菌素(streptozotozin,STZ)(Sigma,批號(hào):S0130);鹽酸二甲雙胍片(上海信誼藥廠有限公司,批號(hào):111128);肝糖原試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20120706);胰島素(insulin,INS)試劑盒(批號(hào):20120701A),葡萄糖激酶(glucokinase,GK)試劑盒(批號(hào):20120701A),葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G-6-Pase)試劑盒(批號(hào):20120701A),丙酮酸激酶(pyruvatekinase,PK)試劑盒(批號(hào):20120701A),果糖激酶-1(fructokinase-1,PFK-1)試劑盒(批號(hào):20120701A),均為美國(guó)RD公司。4.灌胃藥液的制備4.1生地-增液湯取玄參30g,生地黃24g,麥冬24g,加10倍量水,煎煮0.5h,過濾,再加8倍量水,煎煮0.5h,過濾,合并濾液,濃縮制得0.78g/mL。4.2鮮地-增液湯其他制備方法同“4.1”項(xiàng)下,把生地黃換成鮮地黃48g(依據(jù)中國(guó)藥典2010版鮮地用量加倍),壓榨鮮地黃汁兌入即得。4.3熟地-增液湯取熟地黃24g,其他制備方法同“4.1”項(xiàng)下。大鼠血糖代謝關(guān)鍵酶活性檢測(cè)1.分組及用藥SD雄性大鼠70只,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)抽取10只為正常組,其余60只大鼠給予自制高脂飼料(蛋黃3%、蔗糖20%、豬油19%、基礎(chǔ)飼料59%),4周后禁食12h,腹腔注射STZ溶液(35mg/kg),正常組注射同劑量的0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH為4.2-4.5)。72h后測(cè)空腹血糖(FBG),以血糖≥11.1mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn),選擇50只造模成功大鼠,以血糖值為依據(jù),隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、鮮地-增液湯組、生地-增液湯組、熟地-增液湯組,每組10只。鮮地-增液湯組灌胃劑量為10.2g/kg;生地-增液湯組和熟地-增液湯組灌胃劑量均為7.8g/kg;對(duì)照組灌胃鹽酸二甲雙胍,給藥劑量為0.15g/kg;正常組、模型組灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)灌胃給藥3周,每周稱體質(zhì)量1次,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥量。2.檢測(cè)指標(biāo)2.1血糖檢測(cè)于給藥前及給藥1、2、3周后用葡萄糖試劑盒檢測(cè)FBG。2.2胰島素敏感性檢測(cè)于給藥3周后檢測(cè)。即:大鼠禁食12h后,背部皮下注射0.4U/kgINS,剪尾取血,觀察30、60、120min時(shí)血糖的變化情況。2.3血清胰島素水平的測(cè)定末次給藥后大鼠禁食12h,腹主動(dòng)脈取血,按照試劑盒說明測(cè)定血清INS水平。2.4肝糖原含量的測(cè)定處死大鼠后,立即剝?nèi)〈笫蟾闻K,置液氮中冷凍后-70℃保存,按照試劑盒說明測(cè)定肝糖原含量。2.5肝臟糖代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定肝臟用0.9%氯化鈉溶液勻漿后按照試劑盒說明測(cè)定肝臟糖代謝關(guān)鍵酶GK,PFK-1,G-6-Pase,PK的活性。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,組間比較用方差分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)大鼠血清中的關(guān)鍵酶活性的影響1.對(duì)給藥前后糖尿病大鼠FBG的影響見表1。與正常組比較,模型組FBG顯著升高(P<0.01),說明造模成功;與模型組比較,生地-增液湯組FBG在給藥第7天顯著降低(P<0.01),鮮地-增液湯組FBG在給藥第14,21天顯著降低(P<0.05),熟地-增液湯組無(wú)顯著性差異;與生地-增液湯組比較,熟地-增液湯組FBG在給藥第7,14,21天均具有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。3.對(duì)糖尿病大鼠INS及肝糖原含量的影響見表3。與正常組比較,模型組血清INS水平和肝糖元極顯著降低(P<0.01);與模型組比較,生地-增液湯組血清INS水平和肝糖原含量極顯著性升高(P<0.01),鮮地-增液湯組肝糖原含量顯著性升高(P<0.05),熟地-增液湯組無(wú)顯著性差異;與生地-增液湯組比較,鮮地-增液湯和熟地-增液湯組血清INS水平具有極顯著性差異(P<0.01),熟地-增液湯對(duì)肝糖元含量具有顯著性差異(P<0.05)。4.對(duì)肝臟糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響見表4。與正常組比較,模型組GK、PFK-1、PK顯著降低(P<0.01),G-6-Pase顯著升高(P<0.01),說明造模成功;與模型組比較,生地-增液湯組能極顯著升高GK、PFK-1、PK和降低G-6-Pase(P<0.01),鮮地-增液湯組能顯著性升高GK、PK和降低G-6-Pase(P<0.05);與生地-增液湯相比,鮮地-增液湯對(duì)PFK-1具有顯著性差異(P<0.01),熟地-增液湯對(duì)GK、PFK-1、G-6-Pase、PK具有極顯著性差異(P<0.05,P<0.01)。本研究結(jié)果顯示生地-增液湯和鮮地-增液湯能升高血清INS水平和肝糖原含量來(lái)降低血糖和改善INS敏感性,說明這種作用的機(jī)制與減少INS抵抗大鼠肝糖原的合成,增加肝臟中降低的GK、PFK-1、PK活性,降低G-6-Pase活性有關(guān),而熟地-增液湯對(duì)糖代謝的幾個(gè)關(guān)鍵酶活性影響不大。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說明鮮地黃和生地黃具有降低血糖的作用,熟地黃降低血糖作用不明顯,因此建議在臨床降血糖方劑中應(yīng)用鮮地黃和生地黃,不用或少用熟地黃。本次實(shí)驗(yàn)用藥的劑量確定是根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的人常用量按照人∶大鼠=1∶6換算而來(lái),鮮地黃由于富含水分,取樣量加倍。研究結(jié)果證明不僅熟地黃與生地黃作用有異,鮮地黃、生地黃之間也有差別,因此地黃不同炮制品在增液湯方劑中化學(xué)成分的差異有待進(jìn)一步的研究。2.對(duì)給藥后糖尿病大鼠INS敏感性的影響見表2。與正常組比較,模型組INS敏感性極顯著升高(P<0.01);與模型組比較,生地-增液湯組和鮮地-增液湯組INS敏感性在30、60、120min時(shí)顯著降低(P<0.01,P<0.05);與生地-增液湯組比較,鮮地-增液湯I(xiàn)NS敏感性在30、60、120min時(shí)有顯著性差異(P<0.01,P<0.05),熟地-增液湯在30、60min時(shí)有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。增液湯以養(yǎng)肝2型糖尿病是由于INS的分泌絕對(duì)不足或是由于某些抗INS作用的因素影響其生理作用而導(dǎo)致的一種內(nèi)泌代謝性疾病。其典型癥狀是多尿、多飲、多食及消瘦,與中醫(yī)的“消渴”病相似?！跋省钡牟C(jī)主要是陰津虧損,燥熱偏盛,每以清熱生津、滋陰治之。增液湯由玄參(30g)、生地黃(24g)、麥冬(2