糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型建立方法的探討

糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型建立方法的探討

隨著人口老齡化和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐年增加。在糖尿病患者中,動(dòng)脈粥樣硬化性疾病引起的死亡占總死亡率的80%,動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)是糖尿病患者中最多見(jiàn)的并發(fā)癥［1，2］。目前糖尿病合并As的病因及其各種并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,需深入研究,理想動(dòng)物模型的建立是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)之一。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的模型制備方法主要有三大類,一是將糖尿病模型鼠與As模型鼠進(jìn)行雜交［3］二是以糖尿病模型為基礎(chǔ)制備As模型［4-6］;三是以As模型為基礎(chǔ)制備糖尿病模型［3］。第一類方法費(fèi)用高,而且受到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖許可的限制,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不宜使用。第二類方法多采用對(duì)糖尿病鼠喂養(yǎng)高脂飼料,其動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率和程度具有不確定性,難以把握和篩選。第三類方法相對(duì)簡(jiǎn)單可靠,本研究就第三類方法中包含的幾種不同的建模方式進(jìn)行了觀察和對(duì)比,以篩選出最佳的造模方法。1材料和方法1.1各組小鼠體重、stz的比較8周齡SPF級(jí)ApoE－/－雄性小鼠46只,購(gòu)自北京醫(yī)科利昊生物科技有限公司,隨機(jī)分為對(duì)照組10只、高脂組8只、STZ低劑量組16只、STZ高劑量組12只,平均體重21.3g。鏈脲佐菌素(streptozoto-cin,STZ)購(gòu)自Sigma公司,血糖儀及血糖試紙購(gòu)自羅氏公司,血脂測(cè)定使用奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀,基礎(chǔ)飼料購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司,檸檬酸緩沖液購(gòu)自天津百浩生物科技有限公司。1.2stz低劑量組1.2次注射小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,空腹8h,測(cè)基礎(chǔ)體重及空腹血糖。對(duì)照組給予普通飼料;高脂組給予高脂飼料(脂肪21%、膽固醇0.15%)［7］。STZ用檸檬酸緩沖液配置,冰上操作,現(xiàn)配現(xiàn)用,并注意避光,配置好的液體用0.2μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾,腹腔注射液體量為0.1~0.2mL,所有配置溶液在15min內(nèi)注射完畢。STZ低劑量組空腹12h后按55mg/kg的劑量腹腔內(nèi)注射STZ,連續(xù)注射5天［8］。STZ高劑量組空腹12h后按200mg/kg的劑量一次性腹腔注射STZ［9］。注射STZ后注意補(bǔ)足飼料和水,并短時(shí)間內(nèi)喂10%葡萄糖水(1周內(nèi)),之后繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料,每日更換墊料。1.3核心糖酸酯的理化性質(zhì)STZ末次注射后于第10天、21天測(cè)定空腹血糖。STZ末次注射2月后空腹8h測(cè)小鼠血糖,摘眼球取血,全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂,包括甘油三酯(triglyceride,TC)、總膽固醇(totalcholesterol,TG)、高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)。取心臟及升主動(dòng)脈,對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行病理切片,行HE染色,使用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件對(duì)粥樣斑塊進(jìn)行面積測(cè)量。1.4資料處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以u(píng)e0af±s表示,計(jì)量資料采用單因素方差分析,采用LSD法及HSD法等進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)STZ高劑量組在注射STZ后1天即出現(xiàn)了多飲多食的癥狀,STZ小劑量組在末次注射后3天出現(xiàn)多飲多食。STZ小劑量組在末次注射后1周出現(xiàn)多尿,而高脂組一直未出現(xiàn)明顯的多尿。成模后小鼠毛色較對(duì)照組和高脂組差。STZ低劑量組在注射后7周部分出現(xiàn)血尿、少尿、全身水腫的癥狀。2.2血糖檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組及高脂組無(wú)死亡。STZ高劑量組在注射STZ后一周內(nèi)死亡8只(死亡率67%),20天死亡11只(死亡率92%),其中有2只發(fā)生了高血糖(25.6和33.3mmol/L),4只發(fā)生了低血糖(1.8、1.6、1.3及2.8mmol/L),其余5只發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)死亡,未能檢測(cè)血糖;最后一只在注射STZ后57天死亡。STZ小劑量組共死亡6只(總體死亡率37.5%),1只在注射期間發(fā)生低血糖死亡,3只在末次注射后10天內(nèi)出現(xiàn)高血糖死亡,2只在注射后第7周出現(xiàn)血尿、少尿、水腫等癥狀后死亡(圖1)。2.3小鼠總體血糖情況由于STZ高劑量組注射后小鼠大量死亡,未列入統(tǒng)計(jì)。STZ低劑量組從第10天起,大部分小鼠出現(xiàn)明顯的高血糖,從21天起,所有小鼠出現(xiàn)明顯高血糖,且一直穩(wěn)定在較高水平。高脂組空腹血糖呈逐漸升高趨勢(shì),到60天時(shí)達(dá)到7.78mmol/L,按照空腹血糖>7mmol/L的標(biāo)準(zhǔn),達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)(表1)。2.4stz對(duì)大鼠體重的影響各組基礎(chǔ)體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;造模后1月,STZ低劑量組和高脂組體重較對(duì)照組減輕,STZ低劑量組和高脂組間無(wú)差異;造模2個(gè)月后STZ低劑量組體重較對(duì)照組和高脂組均明顯減輕,高脂組體重較對(duì)照組也明顯減輕(表2)。2.5血脂水平STZ低劑量組血脂四項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組及高脂組相比均明顯升高,高脂組與對(duì)照組比較TC、TG、LDL均有明顯升高(表3)。3stz分次注射糖尿病制備糖尿病合并As的模型國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有所提及,但并未對(duì)各種造模方法的效果、可行性進(jìn)行過(guò)對(duì)比,本研究首次對(duì)以As模型鼠為基礎(chǔ)制備糖尿病模型的幾種方法進(jìn)行了比較。大劑量STZ單次腹腔注射制備糖尿病合并As的文獻(xiàn)較少,文獻(xiàn)中提到有兩種方法:一是單次注射200mg/kg,二是100~125mg/kg連續(xù)兩天注射。為了避免第二次注射前的空腹8~12h可能出現(xiàn)的低血糖死亡,本研究采用了單次注射200mg/kg的方法。小鼠在1周內(nèi)死亡92%,其中有的發(fā)生低血糖、有的發(fā)生高血糖,這在注射STZ后該如何喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)了困難。一般認(rèn)為注射STZ后由于胰島的大量破壞,導(dǎo)致血清胰島素猛增,小鼠易出現(xiàn)低血糖,所以需要喂以糖水,但實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)有的小鼠是出現(xiàn)了對(duì)高血糖的不耐受而死亡的,如果所有小鼠均喂以糖水,有可能會(huì)導(dǎo)致一些小鼠更容易出現(xiàn)高血糖而死亡。針對(duì)出現(xiàn)低糖和高糖的小鼠而給予的治療措施(對(duì)于低血糖者給予糖水灌胃、糖水腹腔注射,對(duì)于高血糖者給予鹽水、胰島素皮下/腹腔注射)在STZ高劑量組均未收到效果,考慮可能存在兩點(diǎn)原因:一是大劑量STZ對(duì)小鼠打擊過(guò)大;二是小鼠體型較小,相對(duì)大鼠而言不易施救。從死亡的情況看,大劑量單次注射的方法不易用于糖尿病合并As模型的建立。2.6糖尿病合并as的安全性判斷各組小鼠主動(dòng)脈根部均出現(xiàn)明顯的粥樣斑塊。對(duì)照組與高脂組間斑塊面積大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。STZ低劑量組斑塊面積明顯增多(表4和圖2)。小劑量多次STZ腹腔注射制備的模型小鼠其血糖升高明顯且穩(wěn)定,從末次腹腔注射第10天,血糖明顯升高,且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中維持在較高水平。死亡主要發(fā)生在兩個(gè)階段:一是造模期間,死亡主要為低血糖和高血糖;二是成模后7周,死亡原因考慮為糖尿病腎病、腎衰。因?yàn)橄肓私庠炷：蟮淖匀徊±砩碜兓?在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,我們對(duì)小鼠的血糖沒(méi)有任何的干預(yù),任其升高,這增加了小鼠出現(xiàn)高滲昏迷、酮癥酸中毒、糖尿病腎病等嚴(yán)重的并發(fā)癥而出現(xiàn)死亡的概率。所以,我們認(rèn)為37.5%的死亡率是可以接受的?？紤]到ApoE－/－小鼠是基因敲除鼠,而且世代居住在SPF級(jí)的環(huán)境中,其生存能力相對(duì)于野生型小鼠會(huì)有明顯下降,這可能是該組小鼠死亡率高于用STZ制備單純糖尿病模型死亡率的原因［7，8］。高脂組血糖呈緩慢升高趨勢(shì),本研究中一直到60天才出現(xiàn)符合糖尿病標(biāo)準(zhǔn)的空腹血糖(>7mmol/L),與文獻(xiàn)［7］報(bào)道有一定差異。該研究中血糖升高不顯著,周期長(zhǎng),但方法簡(jiǎn)便、安全。有學(xué)者指出,高糖飲食干預(yù)的ApoE－/－小鼠符合代謝綜合征的表現(xiàn)而不會(huì)出現(xiàn)高血糖,高脂喂養(yǎng)的ApoE－/－小鼠則符合2型糖尿病的表現(xiàn)［7］。我們?cè)谥暗念A(yù)實(shí)驗(yàn)中,小劑量STZ連續(xù)腹腔注射后喂以高糖高脂飲食(豬油18%、蔗糖20%、蛋黃3%、基礎(chǔ)飼料59%),小鼠全部死亡,考慮原因?yàn)楦咛秋嬍吃黾恿诵∈笠蚋咛嵌劳龅娘L(fēng)險(xiǎn)。ApoE－/－小鼠作為As模型,本身就會(huì)發(fā)生高脂血癥和動(dòng)脈粥樣斑塊。本研究中高脂組血脂和斑塊面積與對(duì)照組無(wú)顯著差異,而STZ低劑量組血脂顯著升高,斑塊面積也顯著增加,是糖尿病合并As的理想模型。糖尿病建模成功并無(wú)統(tǒng)一的血糖標(biāo)準(zhǔn),有以空腹血糖>7mmol/L［4，5］,有以空腹血糖≥13.5mmol/L［10］,有以隨機(jī)血糖>11.1mmol/L［11］,有以隨機(jī)血糖>16.7mmol/L［12］。本研究采用的是空腹血糖>7mmol/L的標(biāo)準(zhǔn),而事實(shí)上,STZ低劑量組在注射STZ10天后,小鼠空腹血糖均>11.1mmol/L,且穩(wěn)定地處于較高水平。根據(jù)STZ小劑量組的數(shù)據(jù)推測(cè),如果適當(dāng)減少STZ小劑量組每日注射劑量,可能會(huì)在保證模型成功的前提下減少死亡率,