法國枳桐花粉變應原純化及主要變應原免疫活性分析

法國枳桐花粉變應原純化及主要變應原免疫活性分析

法國梧桐花是春天重要的過敏花粉。近年來，她被列入春季花粉過敏組，進行診斷和脫敏治療，但對過敏成分的國內(nèi)研究甚少。本研究擬對其變應原組分進行分離純化并分析其免疫活性,為今后進一步制備單抗及基因工程生產(chǎn)花粉變應原奠定基礎,從而提高過敏性哮喘的診治水平。1對象和方法1.1哮喘診斷標準收集我院變態(tài)反應?？崎T診法國梧桐花粉過敏性哮喘患者7例,其中男性3例,女性4例。哮喘診斷根據(jù)全國第二屆哮喘會議制定的標準。法國梧桐花粉過敏的診斷,根據(jù)典型的花粉過敏病史,法國梧桐花粉變應原皮內(nèi)試驗風團直徑≥++。1.2方法1.2.1法國梧桐粉素濃縮液的制備于3月中旬至4月上旬采集當?shù)丶儍舴▏嗤┗ǚ?9號分樣篩除雜質,乙醚脫脂。1.2.2柱內(nèi)充填法提取液稱取SephadexG-10015g于蒸餾水350mL中溶脹。將糊狀的SephadexG-100凝膠一次傾入潔凈層析柱中,使之自然沉降。待凝膠沉積后,將多余的溶劑放出,將濃縮的粗制液2mL加至凝膠柱上,打開管夾,使粗制液流入柱內(nèi),連接恒流泵,加入0.1mol·L-1pH7.4PBS洗脫,用核酸蛋白質儀監(jiān)測洗脫情況,得洗脫曲線,有兩個峰,分別收集峰1的升段、峰段、降段、峰2升段。峰2降段富含色素,只含微量蛋白,棄之。重復上述洗脫過程,經(jīng)濃縮、透析、離心,將濃縮后各段洗脫液混合收集,4℃冰箱冷存?zhèn)溆谩?.2.3預測凝膠層壓電泳取標準蛋白、粗制液、峰1的升段、峰段、降段、峰2升段各20μL進行SDS電泳,采用不連續(xù)PAGE,110g·L-1分離膠,50g·L-1濃縮膠,電極緩沖液pH8.3。電泳在室溫中進行,電壓為150V,染料遷移至凝膠下端處,停止電泳。將凝膠片取出,染色1h,傾出染色液,用蒸餾水洗凝膠數(shù)次后加入脫色液,數(shù)小時換液一次,直到背景清晰。根據(jù)標準管分子質量計算各組分蛋白質相對分子質量(Mr)。1.2.4凝膠的“東南角”切取電泳凝膠相同大小的聚乙烯二氟膜(PVDF膜),以電轉移緩沖液潤濕,分別放在電泳后的凝膠上,用潤濕的Whatman3mm濾紙支持,將第二塊潤濕的濾紙貼在凝膠的另一面,形成一套夾心的“三明治”。將“三明治”放置在兩塊充分浸潤的泡沫墊之間,置入盛有電轉移緩沖液的電泳槽內(nèi),電泳2h,取出PVDF膜夾在兩張濾紙之間干燥。1.2.5兔抗人igg-hrp、兔抗人ige-hrp的制備將PVDF膜切成2mm寬的條帶分別置于轉移槽中,用PBS緩沖液洗3次,用含40g·L-1脫脂奶粉封閉,置于搖床搖約1h,再用PBS緩沖液洗3次,然后各加入50μL陽性血清,37℃搖動3h,用PBS緩沖液洗3次后分別加入兔抗人IgG-HRP、兔抗人IgE-HRP5μL,37℃搖動1h,再用PBS緩沖液洗3次。加底物溶液反應至抗原區(qū)帶呈現(xiàn)紫色后終止反應,將PVDF膜夾在濾紙中干燥,成像后暗處保存。2結果2.1l-1ph對小鼠血清中蛋白質的提取濃縮法國梧桐花粉粗制液過SephadexG-100層析柱,用0.01mol·L-1pH7.4PBS洗脫,洗脫曲線(圖1)為兩個峰,第一峰及第二峰升段富含蛋白,第二峰降段含有大量色素,蛋白含量甚微,棄之。收集第一峰及第二峰升段洗脫液。2.2蛋白區(qū)帶及分子質量SDS結果取標準蛋白、粗制液、峰1的升段、峰段、降段、峰2升段各20μL進行SDS,結果見圖2。從圖2中可見,10余條深淺不一的蛋白區(qū)帶,分子質量主要介于16～17ku之間。其中6條帶蛋白含量較多,分子質量分別為71、50、35、39、22、16ku。第一峰升段、峰段、降段電泳圖相似,主要含分子質量22～71ku之蛋白質,第二峰升段以分子質量為14～16ku之蛋白質為主。2.3免疫試驗的結果7例法國梧桐花粉過敏的哮喘患者免疫印跡檢測均有陽性區(qū)帶出現(xiàn)(圖3),而無法國梧桐花粉過敏的哮喘患者血清呈陰性反應,無反應區(qū)帶出現(xiàn)。3蛋白分子質量及免疫印跡檢測法國梧桐又稱二球懸鈴木,為落葉喬木,屬懸鈴木屬。原產(chǎn)于歐洲,我國于60年代后大量栽培作行道、公園、庭院等綠化樹種,目前廣布各地,其中以法國梧桐最多見,其花期為4月中旬至5月上旬,花粉產(chǎn)量很大,風媒傳播,在花期空氣中花粉含量很高。由于體積微小,極易被吸入呼吸道引起變態(tài)反應性疾病。由于花粉變應原浸液中含有無變應原作用的物質和對機體有刺激作用的成分,因此有必要分離純化花粉主要變應原并確定它們的成分和免疫學特性。多數(shù)學者采用凝膠層析分離變應原蛋白,PuttonenE等用凝膠層析法葡聚糖凝膠SephadexG-75分離樺樹花粉變應原,變應原活性主要在分子質量為10～15ku蛋白質之間。國內(nèi)龍如章等用SephadexG-75分離銀杏樹花粉變應原,分子質量30～42ku蛋白質為主要變應原成分。本研究采用SephadexG-100將法國梧桐花粉進行層析,得兩個洗脫峰,經(jīng)SDS檢測各段蛋白質分子質量,結果表明,第一峰蛋白質含量高,分子質量為22～71ku,第二峰升段以分子質量14～16ku之蛋白質為主,第二峰降段僅有弱染色帶,說明此部分蛋白質分子質量低于14ku。免疫印跡(Westernblot)是70年代末在核酸印跡的基礎上發(fā)展起來的一種檢測蛋白質的分子生物學技術。此法綜合了凝膠電泳高分辨率和固相免疫敏感、特異等多種優(yōu)點,不僅可以對蛋白質抗原進行定性、半定量分析,而且可以從混雜蛋白質中檢測特定的抗原并測定其分子質量,適合于變應原特性成分的分析,尤其適用于主要變應原及次要變應原的檢測。孫秀珍等用免疫印跡法對葎草花粉過敏性哮喘患者血清進行分析,結果發(fā)現(xiàn)分子質量100、76、35、28、8ku的蛋白是葎草花粉過敏性哮喘患者的致敏成分。本研究對法國梧桐花粉變應原的免疫印跡分析表明,有4條蛋白帶能與梧桐花粉特異性IgG結合,其分子質量為50、39、22、16ku,說明梧桐花粉含有多種致敏成分。自1996年Ishizaka等發(fā)現(xiàn)IgE后,它一直被認為是介導Ⅰ型變態(tài)反應的主要抗體。近年來,不少研究發(fā)現(xiàn)血清免疫球蛋白IgG參與Ⅰ型變態(tài)反應,起著過敏性抗體的作用(主要是IgG4)。Etievant等在屋塵螨脫敏治療的哮喘患者中發(fā)現(xiàn)IgG4降低者癥狀緩解。Nahm等測定塵螨過敏性哮喘