沈萍微生物學(xué)第十章

第十章微生物與基因

工程一、歷史回顧40年代－－明確DNA是遺傳物質(zhì)50年代－－DNA雙螺旋模型，半保留復(fù)制60年代初－－中心法則，操縱子70年代第一節(jié)基因工程概述關(guān)鍵性實驗技術(shù)突破

1，DNA分子切割與連接技術(shù)2，載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系建立3，Southern雜交，DNA序列分析和PCR反應(yīng)意義；基因工程的定義指對遺傳信息的分子操作或施工，按照人的意愿，把分離到的或合成的基因經(jīng)過改造，插入載體中，然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，使其擴(kuò)增和表達(dá)，從而獲得大量基因產(chǎn)物或產(chǎn)生生物新的性狀。基因工程的基本過程（1）目的基因的獲得

動物，植物，微生物中提取

反轉(zhuǎn)錄mRNAcDNA

化學(xué)合成（2）優(yōu)良載體的選擇

一個復(fù)制子,能大量增殖分子量比較小多種酶單一切點

有選擇性標(biāo)記原核生物－－質(zhì)粒，噬菌體，真核生物－－SV40(動物），Ti(植物）.（3）目的基因與載體DNA體外重組

限制酶切割產(chǎn)生黏性末端，人工接頭低溫退火在連接酶作用下共價結(jié)合－－雜種分子（4）重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)化－－－質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)－－－噬菌體（5）重組受體細(xì)胞的篩選與鑒定遺傳學(xué)方法：插入失活雙抗生素對照篩選免疫學(xué)方法：用抗血清轉(zhuǎn)化E.coli重組質(zhì)粒未轉(zhuǎn)化細(xì)胞原質(zhì)粒插入失活雙抗生素對照篩選重組質(zhì)粒培養(yǎng)基含Tet培養(yǎng)基含Tet+Amp培養(yǎng)基含Tet三、微生物與基因工程的關(guān)系1、基因資源2、基因工程的載體3、基因工程的工具酶4、基因克隆的宿主5、基因表達(dá)的生物反應(yīng)器6、基因工程理論研究基因組文庫用限制性內(nèi)切酶切割細(xì)胞的整個基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長成克隆，文庫中每一克隆只含有特定的基因組DNA片段，含有該生物整套基因組DNA片段的所有克隆就叫做基因組文庫.第二節(jié)，基因的分離、合成和定位誘變通過一系列酶催化作用，使總poly(A)mRNA轉(zhuǎn)變成dsDNA群體并插入到載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，即構(gòu)成包含所有基因編碼序列的cDNA文庫cDNA文庫二、基因的化學(xué)合成1、目前已能合成150——200個核苷酸片段2、應(yīng)用：合成基因或基因元件合成核酸探針合成DNA引物

三、PCR擴(kuò)增基因

PCR－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一種

體外快速擴(kuò)增靶DNA技術(shù)一，基本原理：與體內(nèi)DNA復(fù)制基本原理相似

95℃

變性dsDNA

ssDNA55℃

退火引物與模板互補(bǔ)

72℃

延伸在引物3－OH加dNTP四、基因的定位誘變1、寡核苷酸指導(dǎo)的定位誘變PCR定位誘變第三節(jié)微生物與克隆載體一、質(zhì)粒載體

pBR322質(zhì)粒多拷貝質(zhì)粒相對較小分子量僅4363bp雙選擇標(biāo)記Amp,TetAmp,Tet基因中有限制酶切點，可插入外源基因二、λ噬菌體載體有非必需片段可被外源DNA取代能導(dǎo)入寄主，擴(kuò)增能通過噬菌斑檢測有cos位點可成環(huán)優(yōu)點：可克隆23Kb外源DNA，大于質(zhì)粒載體感染效率達(dá)100%

缺點：克隆的外源DNA受限三、柯斯質(zhì)粒載體

λ噬菌體+質(zhì)粒具λ噬菌體特性具質(zhì)粒載體特性具高容量克隆能力優(yōu)點：可克隆35—48Kb外源DNA

可象質(zhì)粒那樣復(fù)制作為載體的一般要求：1.松弛型質(zhì)粒，自主復(fù)制，拷貝數(shù)高2.分子量?。蓴y帶更多的DNA3.有選擇性標(biāo)記－－便于篩選4.多種酶的單一酶切位點－－便于克隆5.易導(dǎo)入和安全性克隆載體－－適宜于外源DNA在受體中擴(kuò)增的載體。表達(dá)載體－－適宜于外源DNA在受體中表達(dá)的載體?？寺≥d體－－適宜于外源DNA在受體中擴(kuò)增的載體克隆載體的用途：1.用于保存和擴(kuò)增片段小于2Kb的DNA2.構(gòu)建cDNA文庫3.可用于目的DNA的測序4.作為核酸雜交時的探針來源第四節(jié)微生物與基因工程工具酶（1）限制性核酸內(nèi)切酶定義：是一類能識別和切割dsDNA分子種特定堿基順序的核酸內(nèi)切酶命名：EcoRⅠ分離先后順序寄主菌株或型微生物種名加詞宿主，屬名分類：Ⅰ型－－無特異位點不產(chǎn)生特異片段。Ⅲ型－－切割點不在識別特異位點處。Ⅱ型－－分子量小，僅僅需Mg2+能識別和切割dsDNA的特異序列，產(chǎn)生特異性片段。識別－－識別序列4－6個堿基，回文結(jié)構(gòu)功能－－產(chǎn)生黏性末端，平末端。（2）DNApolyease①E.coli

polⅠ5/3/

DNApol活性

5/3/

外切酶活性

3/5/

外切酶活性

Klenow片段5/3/

DNApol活性

3/5/外切酶活性測序，末端標(biāo)記枯草桿菌蛋白酶②TaqDNApolyease

耐熱的依賴DNA的DNApolyease,65KD作用溫度－－75－80℃也有5/3/端外切酶活性③反轉(zhuǎn)錄酶催化以RNA為模板的DNA聚合反應(yīng)，有5/3/端RNA外切酶活性?？捎糜赾DNA合成。（3）DNA連接酶催化兩個獨立的DNA片段5/端磷酸基與3/端羥基之間形成磷酸二酯鍵T4DNA連接