黃曲霉毒素的檢測(cè)課件

真菌毒素簡(jiǎn)介1黃曲霉毒素的檢測(cè)意義2黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)3現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹4中藥黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載狀況5藥典檢測(cè)方法詳解6安全防護(hù)措施7中藥中黃曲霉毒素檢測(cè)方法研究真菌毒素簡(jiǎn)介是真菌在適宜的環(huán)境條件下，在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和動(dòng)物都有害真菌毒素簡(jiǎn)介毒素名稱毒素來(lái)源毒性黃曲霉毒素（常見(jiàn)毒素）黃曲霉、寄生曲霉等肝毒性黃綠青霉毒素黃綠青霉神經(jīng)毒性橘青霉毒素橘青霉腎毒性黃天精和環(huán)氯素島青霉肝毒性T2毒素?cái)M分枝鐮刀菌和梨孢鐮刀菌心衰、出血黃曲霉毒素的起源

第一次發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的起源事件：

1960年，英國(guó)發(fā)現(xiàn)有10萬(wàn)只火雞死于一種以前沒(méi)見(jiàn)過(guò)的病，被稱為“火雞X病”，主要癥狀為食欲減退，羽翼下垂，染病后昏睡死亡，死時(shí)頭腳向后伸。解剖可見(jiàn)肝出血、壞死，腎腫大。再后來(lái)鴨子也被波及。追根溯源，最大的嫌疑是飼料。這些可憐的火雞和鴨子吃的是花生餅?；ㄉ炇腔ㄉビ椭笫Ｏ碌臍?jiān)?，富含蛋白質(zhì)，是很好的禽畜飼料?？茖W(xué)家們很快從花生餅中找到了罪魁禍?zhǔn)?，一種真菌產(chǎn)生的毒素。它被命名為“aflatoxin”，就是現(xiàn)在所說(shuō)的黃曲霉毒素。黃曲霉毒素點(diǎn)擊錄入內(nèi)容點(diǎn)擊錄入內(nèi)容點(diǎn)擊錄入內(nèi)容點(diǎn)擊錄入內(nèi)容顯微鏡下的黃曲霉黃曲霉毒素的檢測(cè)意義

毒性極強(qiáng)1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，僅次肉毒霉素，是目前已知霉菌中毒性最強(qiáng)的。黃曲霉毒素的檢測(cè)意義

毒性極強(qiáng)急性毒性：比氰化鉀大10倍，比砒霜大68倍。慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。黃曲霉毒素的檢測(cè)意義

存在極其廣泛主要存在于土壤，動(dòng)植物及各種堅(jiān)果中。家庭自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。未能及時(shí)曬干或儲(chǔ)藏不當(dāng)?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在農(nóng)作物正常的生長(zhǎng)期中也可以形成。黃曲霉毒素的檢測(cè)意義存在極其廣泛中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的有：種子、果實(shí)、糧谷類中藥材或含此類藥材的中成藥；發(fā)酵類中藥；貯存期中藥材、中成藥;油性成分多的中藥材歐盟（μg/kg）德國(guó)（μg/kg）中國(guó)香港（μg/kg）中國(guó)（μg/kg）黃曲霉毒素AlfatoxinB1食用花生8，食用堅(jiān)果、玉米、調(diào)味品5，食用干制水果及其制品2，生乳、熱處理牛奶，嬰幼兒食品0.1，嬰幼兒奶粉0.1，嬰幼兒食療食品0.1.藥材

2藥材5玉米、花生及其制品20，大米、植物油10，其他糧食、豆類、發(fā)酵食品5，嬰幼兒配方食品5.藥材5黃曲霉毒素AlfatoxinsB1,B2,G1,G2食用堅(jiān)果、玉米、調(diào)味品10，食用干制水果及其制品4.藥材4藥材10藥材10黃曲霉毒素的檢測(cè)意義國(guó)際上對(duì)中藥材中黃曲霉毒素的檢測(cè)越來(lái)越多黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，分為B族和G族兩大類及其衍生物ACCDPPTB族：藍(lán)色熒光1G族：黃綠色熒光212黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)生長(zhǎng)溫度最低6-8℃，最高達(dá)44-46℃，32℃時(shí)黃曲霉毒素B1的產(chǎn)量最高。

黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)類似，目前發(fā)現(xiàn)約20余種，已分離鑒定出12種：B1,B2,G1,G2,M1,M2,P1,Q,H1,GM,B2a和毒醇.

基本結(jié)構(gòu)：二呋喃環(huán)和香豆素,B1是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?即含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān).

黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)主要分子型式B1,B2,G1,G2,M1,M2M1是B1在體內(nèi)經(jīng)過(guò)羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物M1、M2主要存在于牛奶中B1：最常見(jiàn)、毒性及致癌性最強(qiáng)黃曲霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式黃曲霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。原理：抗原、抗體反應(yīng)，第一次發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素的起源事件：追根溯源，最大的嫌疑是飼料。大米、植物油10，微柱篩選法：半定量，測(cè)總量追根溯源，最大的嫌疑是飼料。黃曲霉毒素危害極大，應(yīng)引起重視這些可憐的火雞和鴨子吃的是花生餅。中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的有：種子、果實(shí)、糧谷類中藥材或含此類藥材的中成藥；慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。前者為基本毒性結(jié)構(gòu)，后者與致癌有關(guān).薄層層析法：靈敏度低，定量困難中性溶液及弱酸性溶液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，強(qiáng)堿溶液中分解迅速B1、G1熒光遇水要淬滅，檢測(cè)前需要衍生化花生餅是花生榨油之后剩下的殘?jiān)?，富含蛋白質(zhì)，是很好的禽畜飼料。測(cè)定：吸取混合對(duì)照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹混合對(duì)照品溶液的制備：液體標(biāo)液（B1\B2\G1\G2=1\0.歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況中性溶液及弱酸性溶液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，強(qiáng)堿溶液中分解迅速黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻原理：抗原、抗體反應(yīng)，黃曲霉毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)式理化性質(zhì)相對(duì)分子量為312-346難溶于水、易溶于油，甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中中性溶液及弱酸性溶液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，強(qiáng)堿溶液中分解迅速純品為無(wú)色結(jié)晶.在紫外光燈下，B1、B2發(fā)藍(lán)色熒光，G1、G2發(fā)綠色熒光耐高溫，一般烹調(diào)溫度不能破壞，B1的分解溫度為268℃紫外線對(duì)低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹薄層層析法：靈敏度低，定量困難HPLC-紫外檢測(cè)法：不衍生，靈敏度低，采用UPLC可以增強(qiáng)靈敏度HPLC-熒光檢測(cè)法：需衍生，靈敏度高（目前藥典采用此法）黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹免疫化學(xué)分析方法酶聯(lián)免疫吸附法：快速、簡(jiǎn)便、單一毒素、假陽(yáng)性多免疫親和柱-熒光分光光度法：高效、無(wú)毒、假陽(yáng)性多微柱篩選法：半定量，測(cè)總量一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法：快速、現(xiàn)場(chǎng)大批量初篩HPLC/MS/MS：不衍生，靈敏度高，假陽(yáng)性少，成本高LC-MS/MSHPLCTLCGC色譜學(xué)方法黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹免疫學(xué)方法ELISA膠體金黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹2005年增補(bǔ)本附錄：第一次增加了黃曲霉毒素測(cè)定法歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

2010年版一部正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品種項(xiàng)下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測(cè)定法歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

2010年版一部第二增補(bǔ)本：

修訂了附錄方法刪除了流速規(guī)定增訂了另一種衍生方法：即光化學(xué)衍生法取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定2015年版總則草案歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

增加了第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法附注：當(dāng)測(cè)定結(jié)果超出限度時(shí),采用第二法進(jìn)行確認(rèn)2351黃曲霉毒素測(cè)定法2015年版總則草案歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

糧谷類、種子類、油性成分多的品種應(yīng)注意黃曲霉毒素的檢測(cè)處方中含有易污染的藥材以及生粉投料的中成藥品種應(yīng)注意相關(guān)真菌毒素的檢測(cè)9305中藥中真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)原則2015年版總則草案歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

根據(jù)具體品種和具體污染狀況，參考相關(guān)品種國(guó)外藥典和各國(guó)、各國(guó)際組織相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)等規(guī)定，盡可能控制在最低范圍內(nèi)B1限量和B1、B2、G1、G2總和的限量9302中藥有害殘留物限量制定

指導(dǎo)原則歷年中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)收載狀況

2015年版正文未查到具體品種規(guī)定是否有變化黃曲霉毒素藥典檢測(cè)方法詳解

液相條件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化學(xué)衍生?；旌蠈?duì)照品溶液的制備：液體標(biāo)液（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3ug/ml）梯度稀釋500倍。供試品溶液的制備：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫親和柱純化。測(cè)定：吸取混合對(duì)照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取供試品溶液20-25μl，測(cè)定。追根溯源，最大的嫌疑是飼料。B1,B2,G1,G2,操作中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及注意點(diǎn)黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)中藥黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載狀況一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。相對(duì)分子量為312-346微柱篩選法：半定量，測(cè)總量黃曲霉毒素檢測(cè)安全防護(hù)措施注意點(diǎn)：澄清、含醇量、pH、流速、脫水檢測(cè)前先多了解被檢測(cè)物質(zhì)和成分的性質(zhì)，了解檢測(cè)方法的原理及實(shí)驗(yàn)中每一步操作的目的，避免不必要的差錯(cuò)B1、G1熒光遇水要淬滅，檢測(cè)前需要衍生化最低6-8℃，最高達(dá)44-46℃，32℃時(shí)黃曲霉毒素B1的產(chǎn)量最高。注意點(diǎn)：澄清、含醇量、pH、流速、脫水解剖可見(jiàn)肝出血、壞死，腎腫大。取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定假陽(yáng)性及假陰性的排除：多種方法比較，隨行空白，液質(zhì)聯(lián)用，關(guān)閉衍生器B1、G1熒光遇水要淬滅，檢測(cè)前需要衍生化中藥中黃曲霉毒素藥典檢測(cè)方法詳解

方法來(lái)源：《中國(guó)藥典》2010年版第二增補(bǔ)本附錄ⅨV黃曲霉毒素測(cè)定法基本步驟提取過(guò)柱洗脫測(cè)定樣品前處理免疫親和柱純化柱后衍生、HPLC檢測(cè)上樣洗滌洗脫檢測(cè)流程提取過(guò)濾除雜稀釋黃曲霉毒素檢測(cè)主要設(shè)備氣孔操作架免疫親和柱黃曲霉毒素檢測(cè)主要設(shè)備氣孔操作架免親和柱黃曲霉毒素檢測(cè)主要設(shè)備HPLC-熒光檢測(cè)器光化學(xué)衍生器黃曲霉毒素檢測(cè)主要設(shè)備免疫親和柱IAC③洗脫，將結(jié)合在抗體上的待測(cè)物沖洗下來(lái)進(jìn)入儀器檢測(cè)①上樣，載體上的抗體結(jié)合樣品中的待測(cè)物②清洗，將雜質(zhì)沖洗干凈抗待測(cè)物（半抗原）抗體待測(cè)物（半抗原）無(wú)關(guān)雜質(zhì)固相載體（凝膠）①②③免疫親和柱的原理用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上然后裝柱而成方法詳解操作中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及注意點(diǎn)對(duì)照品溶液的配制取樣：混勻，嚴(yán)格按要求取樣，要有代表性提?。悍绞娇杀容^后選擇濾過(guò):普通濾紙有吸附，可采用玻璃纖維濾紙或離心方法詳解操作中可能出現(xiàn)的問(wèn)題及注意點(diǎn)凈化和富集采用免疫親和柱，柱子是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上然后裝柱而成原理：抗原、抗體反應(yīng)，注意點(diǎn)：澄清、含醇量、pH、流速、脫水其它注意事項(xiàng)：親和柱儲(chǔ)存、使用溫度，接頭、容器洗滌方法詳解黃曲霉毒素標(biāo)液supelco黃曲霉毒素的衍生化衍生原因B1、G1熒光遇水要淬滅，檢測(cè)前需要衍生化藥典附錄收載的兩種衍生方法碘衍生法：碘作為衍生劑，對(duì)衍生溫度有要求，試劑對(duì)儀器有腐蝕性，需要沖洗。光化學(xué)衍生法：紫外光燈（254）nm照射，操作簡(jiǎn)單，對(duì)衍生溫度無(wú)要求，無(wú)需沖洗衍生原理AFB1AFG1黃曲霉毒素的衍生化紫外光燈照射紫外光燈照射

增強(qiáng)B1、G1的熒光強(qiáng)度。黃曲霉毒素的衍生化黃曲霉毒素的檢測(cè)熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)=360nm(或365nm)，發(fā)射波長(zhǎng)=450nm靈敏度高，可用于痕量檢測(cè)檢測(cè)方法詳解

方法難點(diǎn)：痕量分析：PPb級(jí)別，靈敏度高，要有質(zhì)量保證體系：重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、隨行回收、陰性樣品、陽(yáng)性樣品、質(zhì)控樣品黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻中藥樣品種類多，基質(zhì)各異，成分復(fù)雜，提取困難假陽(yáng)性及假陰性的排除：多種方法比較，隨行空白，液質(zhì)聯(lián)用，關(guān)閉衍生器報(bào)告具體值低于檢測(cè)限（標(biāo)出檢測(cè)限）報(bào)告具體值未檢出限度內(nèi)限度外結(jié)果報(bào)告黃曲霉毒素檢測(cè)安全防護(hù)措施

應(yīng)有相應(yīng)的安全、防護(hù)措施，并不得污染環(huán)境黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品禁用固體實(shí)驗(yàn)全程佩戴手套殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應(yīng)泡在專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液內(nèi)，浸泡24小時(shí)以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。流動(dòng)相單獨(dú)收集，先用次氯酸鈉滅毒，再按常規(guī)處理?？偨Y(jié)總結(jié)黃曲霉毒素危害極大，應(yīng)引起重視檢測(cè)前先多了解被檢測(cè)物質(zhì)和成分的性質(zhì)，了解檢測(cè)方法的原理及實(shí)驗(yàn)中每一步操作的目的，避免不必要的差錯(cuò)檢測(cè)過(guò)程中大家一定要注意安全措施的防護(hù)，保護(hù)好自己、保護(hù)好環(huán)境謝謝大家！黃曲霉毒素點(diǎn)擊錄入內(nèi)容點(diǎn)擊錄入內(nèi)容點(diǎn)擊錄入內(nèi)容點(diǎn)擊錄入內(nèi)容顯微鏡下的黃曲霉黃曲霉毒素的檢測(cè)意義

毒性極強(qiáng)急性毒性：比氰化鉀大10倍，比砒霜大68倍。慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。黃曲霉毒素的檢測(cè)意義存在極其廣泛中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的