核增生李斯特氏菌檢測概述

單核增生李斯特氏菌

檢測概述1精選課件內(nèi)容簡介李斯特氏菌屬單核增生李斯特氏菌生物學(xué)特性流行病學(xué)致病性實驗室危害及其預(yù)防檢測程序快速檢測方法2精選課件李斯特氏菌屬李斯特氏菌屬〔Listeria〕普遍存在于環(huán)境中，最新的分類學(xué)研究說明，其分為六個種：單核增生李斯特氏菌〔Listeriamonocytogenes〕伊氏李斯特氏菌〔Listeriaivanovii〕無害李斯特氏菌〔Listeriainnocua〕斯氏李斯特氏菌〔Listeriaseeligeri〕威氏李斯特氏菌〔Listeriawelshimeri〕格氏李斯特氏菌〔Listeriagrayi〕

在李斯特氏菌屬的六個種中，只有兩種致病菌：單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他動物發(fā)病。但是，其中通常只有單核增生李斯特氏菌和人類的李斯特氏菌癥〔listeriosis〕相關(guān)。因此，李斯特氏菌中最有檢測意義的是單核增生李斯特氏菌。3精選課件生物學(xué)特性

---菌體形態(tài)及染色特征革蘭氏陽性；小的、類似球形桿菌，0.4~0.5×0.5~2μm，在有些培養(yǎng)基中稍彎，兩端鈍圓，單個、成短鏈、細(xì)胞彼此連成V形，或成群的細(xì)胞沿長軸方向平行排列，在較老的或生長不良的培養(yǎng)物中，可能形成絲狀；20-25℃以4根周生鞭毛運動，在37℃只有較少的鞭毛或1根鞭毛；無芽孢、無莢膜。4精選課件5精選課件生物學(xué)特性

---培養(yǎng)特性兼性厭氧；在20--25℃培養(yǎng)有動力，穿刺培養(yǎng)2-5天可見倒立傘狀生長，肉湯培養(yǎng)物在顯微鏡下可見翻跟斗運動。生長溫度范圍為2-42℃〔也有報道在0℃能緩慢生長〕，最適培養(yǎng)溫度為35--37℃。pH范圍pH4.4-pH9.6。6精選課件生物學(xué)特性

---培養(yǎng)特性在固體培養(yǎng)基上，菌落初始很小，透明，邊緣整齊，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺種血平板培養(yǎng)后可產(chǎn)生窄小的β-溶血環(huán)。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆瓊脂(TSAYE)瓊脂上，用45°角入射光照射菌落，通過解剖鏡垂直觀察，菌落呈蘭色、灰色或蘭灰色。7精選課件生物學(xué)特性

---生化反響觸酶陽性，氧化酶陰性。能發(fā)酵多種糖類，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，如發(fā)酵葡萄糖、乳糖、水楊素、麥芽糖、鼠李糖、七葉苷、蔗糖〔遲發(fā)酵〕、山梨醇、海藻糖、果糖，不發(fā)酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、側(cè)金盞花醇、棉子糖、衛(wèi)矛醇和纖維二糖。不利用枸櫞酸鹽，40%膽汁不溶解，吲哚、硫化氫、尿素、明膠液化、硝酸鹽復(fù)原、賴氨酸、鳥氨酸均陰性，VP、甲基紅試驗和精氨酸水解陽性。8精選課件生物學(xué)特性

---血清型根據(jù)菌體〔O〕抗原和鞭毛(H)抗原，將單增李氏菌分成13個血清型，分別是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和“7〞。致病菌株的血清型一般為1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后兩型尤多。9精選課件生物學(xué)特性

---抵抗力該菌對理化因素抵抗力較強，在土壤、糞便、青儲飼料和食品中能長期存活；對堿和鹽抵抗力強，60-70℃經(jīng)5-20min可殺死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氫氧化鈉、2.5%福爾馬林20min可殺死此菌；濕熱滅菌〔121℃，至少15min〕和干熱滅菌〔160-170℃，至少1hr〕可殺滅該菌，對紫外線和γ射線敏感；該菌對青霉素、氨芐青霉素、四環(huán)素〔已產(chǎn)生抗性〕、氨基糖苷類、氯霉素均敏感。10精選課件流行病學(xué)

分布：廣泛存在于自然界中，土壤、地表水、污水、廢水、青儲飼料、動植物及其食品中均有該菌存在，所以動物很容易食入該菌，并通過口腔-糞便的途徑進(jìn)行傳播寄主范圍：哺乳動物、鳥類、魚類、甲殼類和昆蟲11精選課件流行病學(xué)

據(jù)報道，有1-10%的人類腸道中存在單核增生李斯特氏菌，4-8%的水產(chǎn)品、5-10%的奶及其產(chǎn)品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被該菌污染。相關(guān)食品：鮮奶、巴氏消毒奶、奶酪〔尤其是軟奶酪〕、冰激凌、生的蔬菜、發(fā)酵過的生肉制作的香腸、生的和加工過的禽肉、各種生的肉類、生的和煙熏的魚肉。約有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。12精選課件1996年至1999年，因單核增生李斯特氏菌回收的食品種類〔來源：USDA及FDA報告〕13精選課件致病性及其治療該病的臨床表現(xiàn)，健康成人個體出現(xiàn)輕微類似流感病癥，新生兒、孕婦、免疫缺陷患者表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、化膿性結(jié)膜炎、發(fā)熱、抽搐、昏迷、自然流產(chǎn)或死嬰、腦膜炎、敗血癥直至死亡。由該菌造成的腦膜炎的致死率可高達(dá)70%，敗血癥的死亡率達(dá)50%，圍產(chǎn)期或新生兒感染的死亡率超過80%，懷孕期婦女的感染，母親通常能存活下來?？股刂委?，用青霉素或氨芐青霉素注射給藥，或與氨基糖苷類抗生素一起用藥。14精選課件感染人群感染劑量未知，但與該菌的毒力和易感人群的年齡、免疫狀態(tài)有關(guān)。易感者：孕婦/胎兒—圍產(chǎn)期和新生兒的感染；接受皮質(zhì)激素、抗癌劑治療、器官移植治療、艾滋病患者等免疫缺損者；癌癥病人—

尤其是白血病的患者；不太常見的報道—糖尿病、肝硬化、哮喘和潰瘍性結(jié)腸炎的患者；年紀(jì)較大的人；沒有免疫缺陷的健康的人，食用污染該菌尤其是大量污染該菌的食品后，也有患病的危險。15精選課件致病機(jī)理單增李氏菌的抗原結(jié)構(gòu)與毒力無關(guān)，它的致病性與毒力機(jī)理如下：1、寄生物介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)增生，使它附著及進(jìn)入腸細(xì)胞與巨噬細(xì)胞；2、抗活化的巨噬細(xì)胞，單增李氏菌有細(xì)菌性過氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬細(xì)胞內(nèi)的過氧物〔為殺菌的毒性游離基團(tuán)〕分解；3、溶血素，即李氏桿菌素O，可以從培養(yǎng)物上清液中獲得，有α和β兩種，為毒力因子。16精選課件實驗室危害不是一種普遍的與實驗室相關(guān)的傳染病，目前只有少數(shù)有報道的案例發(fā)生；直接攝取是最普遍的一種感染方式，除此之外，暴露在該菌高濃度的氣溶膠中，也可通過眼睛和破損的皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)造成感染。17精選課件本卷須知生物平安2級，操作時應(yīng)有相應(yīng)的防污染設(shè)施，在進(jìn)行可能產(chǎn)生氣溶膠的操作時，應(yīng)在生物平安柜內(nèi)完成；在直接接觸有感染性的材料時，必須穿著實驗服，戴手套和護(hù)目鏡；懷孕的婦女應(yīng)防止接觸傳染物。18精選課件操作要求濺灑：使氣溶膠沉降，穿著防護(hù)服裝，用紙巾輕輕覆蓋濺灑處，參加1%次氯酸鈉溶液，由周邊向中心加，在清理之前要留充足的接觸時間〔30min〕；廢棄：在廢棄前應(yīng)先采取凈化措施，高壓蒸汽滅菌、化學(xué)消毒、燃燒等；儲存：在有適當(dāng)標(biāo)記的密封容器內(nèi)儲存。19精選課件檢測程序

---增菌目前常用的單核增生李斯特氏菌檢測增菌肉湯主要有半量Fraser肉湯、Fraser肉湯〔FB〕、UVM〔ModifiedUniversityofVermontbroth，也叫UVM1〕、LEB〔Listeriaenrichmentbroth〕和BLEB〔bufferedListeriaenrichmentbroth〕20精選課件半量Fraser肉湯和Fraser肉湯具有選擇性和區(qū)別性。參加檸檬酸鐵銨和七葉靈，起到區(qū)別的作用。李斯特氏菌可以水解七葉靈，與培養(yǎng)基中的鐵離子反響，使培養(yǎng)基變黑，可直觀的從培養(yǎng)液的顏色就可以判斷是否有單核李斯特氏菌的生長。氯化鋰、吖啶黃和萘啶酮酸作為選擇性因子。半量Fraser肉湯與Fraser肉湯所用的添加劑一樣半量Fraser肉湯：萘啶酮酸10mg/L，吖啶黃12.5mg/LFraser肉湯：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黃的25mg/L21精選課件UVMUVM只有選擇性沒有區(qū)別性參加萘啶酮酸和鹽酸吖啶黃，作為選擇性因子。雖然其中含有七葉靈，但是沒有添加檸檬酸鐵銨，不能發(fā)生黑色的顏色反響。22精選課件LEB和BLEB只有選擇性沒有區(qū)別性LEB是在TSB-YE的根底上參加鹽酸吖啶黃、萘啶酮酸和放線菌酮等選擇性因子；參加的丙酮酸鈉，有助于受損細(xì)胞的恢復(fù)；不含七葉靈和檸檬酸鐵銨，無顏色反響B(tài)LEB是在LEB根底上參加緩沖體系：磷酸二氫鉀和磷酸氫二鈉23精選課件檢測程序

---別離別離培養(yǎng)基有：OXA、PALCOM、LPM、MOX等，但首選仍然是OXA。別離原理主要是基于李斯特氏菌具有β－D－葡萄糖苷酶的活性，能水解培養(yǎng)基中的七葉靈，產(chǎn)生七葉苷，與鐵離子產(chǎn)生顏色反響而，使菌落為棕褐色，并帶有褐色暈圈，而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能發(fā)生這種反響還有一些選擇性顯色培養(yǎng)基，如BCM、ALOA、CHROMagarlisteria、Rapid’L.mono等，其原理主要是檢測由毒力基因編碼的溶血素，而此種溶血素只存在于單核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中，因而可以很好的將此兩種菌同李斯特屬的其他種分開。24精選課件OXA平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911748h，35℃培養(yǎng)25精選課件OXA平板無害李斯特氏菌ATCC3309048h，35℃培養(yǎng)26精選課件檢測程序

---鑒定藍(lán)色菌落檢驗〔Henryillumination〕典型運動：相差顯微鏡，輕微旋轉(zhuǎn)或翻跟頭動力試驗：7天，傘形生長過氧化氫酶試驗：陽性革蘭氏染色：陽性短桿菌溶血試驗：穿刺接種血平板硝酸鹽復(fù)原試驗：5天，陰性糖發(fā)酵試驗：葡萄糖、麥芽糖和七葉靈，李斯特菌屬反響均為陽性，除格氏李斯特甘露醇陰性，李斯特其他種甘露醇陰性，木糖和鼠李糖最有檢測意義27精選課件動力試驗28精選課件

血平板單核增生李斯特氏菌ATCC1911736h，35℃培養(yǎng)29精選課件

血平板無害李斯特氏菌ATCC3309036h，35℃培養(yǎng)30精選課件

血平板伊氏李斯特氏菌ATCC1911924h，35℃培養(yǎng)31精選課件單核增生李斯特氏菌檢測流程25g樣品+225mlBLEB根底〔參加丙酮酸鈉〕參加萘啶酮酸、鹽酸吖錠黃、放線菌酮30℃4hr劃線接種OXA平板30℃24hr和48hr科瑪嘉李氏菌顯色培養(yǎng)基TSA-YE分純35℃24hr-48hr35℃24hr過氧化氫酶試驗、革蘭氏染色、溶血試驗、糖發(fā)酵試驗〔木糖、鼠李糖〕APIListeria35℃24-48hr報告結(jié)果35℃18-24hr32精選課件方法名稱一次增菌二次增菌分離鑒定快速方法SN0184-1993加工MBP30℃，18-24hEB30℃，24/48hMMA/OXA（35℃，24-48h）藍(lán)色菌落；典型運動；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗；尿素酶試驗；硝酸鹽還原；MR-VP；三糖鐵；糖發(fā)酵；動力試驗；協(xié)同溶血*；血清學(xué)檢驗*；小鼠毒力試驗*無未加工EB（30℃，24/48h）GB/T4789.30-2003EB（30±1℃，48h）MMA（30±1℃，24-48h）藍(lán)色菌落；三糖鐵；動力試驗；染色鏡檢（革蘭氏染色、典型運動）；生化特性（溶血反應(yīng)、硝酸鹽還原、尿素酶、MR-VP、糖發(fā)酵）；小鼠毒力試驗；協(xié)同溶血無LB1（30±1℃，24h）LB2（30±1℃，24h）FDABLEB+Phy（30℃，4h）BLEB+Phy+三種抑菌劑（30℃，20/44h）OXA/PALOM/MOX/LPM+七葉靈+Fe3+推薦BCM/ALOA/RapidL'mono/CHROMagarListeria藍(lán)色菌落*；典型運動或動力試驗；過氧化氫酶；革蘭氏染色；溶血試驗；硝酸鹽還原*；糖發(fā)酵；協(xié)同溶血；血清學(xué)檢驗；小鼠毒力試驗*篩選、鑒定都可以使用快速方法USDAUVM（30±2℃，22±2h）FB（35±2℃，26-48±2h）MOX（35±2℃，26-48±2h）初步鑒定：純菌菌落形態(tài)；典型運動；生化鑒定：MICRO-ID?

Listeria或Api?

Listeria或BAM等方法中的傳統(tǒng)生化反應(yīng)；協(xié)同溶血遺傳鑒定：核糖體RNA檢測；PFGE*篩選用的快速方法必須經(jīng)過確認(rèn)后才可使用鑒定中用到MICRO-ID?

、Api?、GenProbeAccuProbe?、GENE-TRAK?各官方方法比較33精選課件各官方方法比較方法名稱一次增菌二次增菌分離鑒定快速方法CFIAMFHPB-30LEB（UVM）（30℃，24/48h）MFB（35℃，24-48h）OXA+LPM或MOX或PALCOM典型運動或動力試驗；溶血試驗；甘露醇；木糖；鼠李糖；快速鑒定試劑盒*；過氧化氫酶*；革蘭氏染色*；協(xié)同溶血*；血清學(xué)試驗*作為鑒定的可選步驟，允許使用快速方法，如Vitek或API、MicroIDListeria、ListeraAccuprobe?ISO11290-1:1996（E）半量Fraser肉湯（30℃，24±2h）Fraser肉湯（35或37℃，48±2h）OXA和PALCOM（30、35或37℃，24-48h，）PALCOM平板微需氧或好氧條件培養(yǎng)藍(lán)色菌落*；過氧化氫酶；革蘭氏染色；動力試驗或典型運動*；溶血試驗；糖發(fā)酵試驗；協(xié)同溶血；送參考實驗室（血清或噬菌體分型）無NMKLNo.1362nd1999LBⅠ（30.0±1.0℃，24±3h）LBⅡ（30.0±1.0℃，24±3h）或Fraser肉湯（37.0±1.0℃，48±4h）OXA和PALCOM（37.0±1.0℃，24±3/48±4h，好氧或微需氧）溶血試驗；過氧化氫酶；革蘭氏染色；典型運動動力試驗；糖發(fā)酵試驗；送參考實驗室（血清、噬菌體、DNA或酶分型）允許使用經(jīng)過確認(rèn)的商業(yè)化生產(chǎn)的單核增生李斯特氏菌菌株鑒定試驗，但沒列明具體試劑盒名稱34精選課件紅肉、禽、蛋和環(huán)境樣品中別離和鑒定單核增生李斯特氏菌的方法35精選課件紅肉、禽、蛋和環(huán)境樣品中別離和鑒定單核增生李斯特氏菌的方法36精選課件FDA：李斯特氏菌屬的快速篩選試劑盒Table2.

ListeriaGenusDetectionTestKitsPrescribedforRegulatoryScreeningAOACOfficialMethod993.09.2000.Listeriaindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricdeoxyribonucleicacidhybridizationmethod(GENE-TRAKListeriaAssay).(3,14)AOACOfficialMethod994.03.2000.Listeriamonocytogenesindairyproducts,seafoods,andmeats.Colorimetricmonoclonalenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod(ListeriaTek).(5,15,32)AOACOfficialMethod995.22.2000.Listeriainfoods.Colorimetricpolyclonalenzymeimmunoassayscreeningmethod(TECRAListeriaVisualImmunoassay[TLVIA]).(6,30)AOACOfficialMethod996.14.2000.Assurance(PolyclonalEnzymeImmunoassayMethod).(7,21)AOACOfficialMethod997.03.2000.VisualImmunoprecipitateAssay(VIP).(8,22)AOACOfficialMethod999.06.2000.EnzymeLinkedImmunofluorescentAssay(ELFA)VIDASLISAssayScreeningMethod.(9,23)37精選課件FDA：生化鑒定的替代方法VitekAutomicrobicGramPositiveandGramNegativeIdentificationcards(bioMerieux,Hazelwood,MO)APIListeria(bioMerieux,Marcy-l'Etoile,France)whichdoesnotrequireanadditionalCAMPtestTheMICRO-IDTMkit(bioMerieux,Hazelwood,MO;1,24)permitsspeciationofListeriaisolatesiftheirCAMPreactionsareknownThePhenotypeMicroArrayforListeria(BiOLOG,Hayward,CA)isanotherrecentlyintroducedkit.38精選課件FDA：鑒定單核增生李斯特氏菌的試劑盒Table3.TestKitsUsefulinConfirmingListeriaIsolatesasListeriamonocytogenesornotAccuProbeTMListeriamonocytogenescultureconfirmationtest(Gen-Probe,Inc,SanDiego,CA)GeneTrak

Listeriamonocytogenestestkit(Neogen,Lansing,MI)Probelia

Listeriamonocytogenestestkit(BioControl,Seattle,WA)VIDASListeriamonocytogenestestkit(bioMerieux)TransiaPlate

Listeriamonocytogenes(DiffchambSA,Lyon,France)FDA,SRLapplicationofNiederhauseretal.methodforPCRdetectionandidentificationofL.

monocytogenes

BAX

Listeriamonocytogenestest.(Qualicon,Inc.,Wilmington,DE)39精選課件單核增生李斯特氏菌檢測

快速方法VIDASVITEKAPIListeriaBAXTECTA40精選課件VIDASLMO：單核增生李斯特VIDASLIS：李斯特氏菌VIDAS41精選課件VITEK42精選課件APIListeria43精選課件BAX44精選課件TECRA?UNIQUEPLUS?TECRA?UNIQUETM45精選課件neneAM2ijg&QR2Vo!8wbl27Zy!CiE9cz%A*a!N+bNoi4)(Om5nvByt0t+io&48ItGqKeTBi$hoKdIjqR&#R4Cjl&R)3ohXIb+VufRCZnmNOioMyRT5woEWZtrylQ#QjGsat&18dFbm#VntAGV-Hq4gSFNCFCP9NGNC4)rZXf)x$WTDF7gAaCj6e5i464EInFW&FquNfm%)#j8vK9TQ%O+a+!cph*50G+Ipo$!R3TMBYecO-DMbRCv)MKs-$Y1PmSaYz*YYuMZk!10xg$tiAX0BA0uECETuH2l+Uy%b8d!e63d-zIwI-dPV5zy-V1JrIgPNbwd7-KT#%mU1KdZgh-K$Rvr)$nkJYGK#CAeYpNTrMdl!NGdp-btqO7vfsuhYfNS4dqd!L6oMSR0kPZiPGY-kaE)rjo!uNNHE6&4VIcU4E8MS4M4zjypP3-UjQug7A+Bmjrw9cfoHno$2$vbcVATmDDT6JuC6e)-&C$6COC2isyvs3abzw(kO3r82Rsd1EF9x#sDA0pRyZmUI1(%XYS6WI(hBMxfRgq%4gH9fIGc&zWTPpMiYuvd+GqkRpMrTE%19qO%t076uPpZuEqyD#!Ts&gbP+SUtfFdg&x*SZVnnZKf*2cETC!sNd$(uNFiUxocPJMrVlSgItSjmeMQKebOhT(9V8tmPmf8fT8)((j!nmg4q0zLL!y8qpewHm0B68btH!BE9zH#FqWJj%u(I+VSu!BRGk1TwBqI*Bb3T0*QavGbi6tRA0QT$2zDuJ#VssSQxFy7pdDq-s257D7lrJ0tdB$QSIJNhUvbl0J5Srn2QnvVbkz+7f0iw%miEQzq0X5Pm(ZbNT)KdlD-XPd4pOoVWxL9xp7zSuG74Oc8WR+)Z73uNFXkFgrht$u#TtKVsLDCYjFTzEhvEjP39AkHVvJyHVLAfBXyBI35CnA%ko4psjbL0ZcB1kSJ-#k4%s(on2qE4VXr+3ysTG5N%kcHtrsez1S%CWJ3!4KPKEQHw-hMkFSENawIN2PQzl-8Zhgf8%V)rpx%$Z5sp6gYY&$1uHDBr8eID-EacV9n9Xw3bn6xlJkBzsqMdeoiyntWRpCSj%xmT9ZF-aWO7iIqeRZrE3*5Zx#xE-*K0d8u8ZiloHgcu+WMu(W1CY-%YwC46eBn#uIoYalKicU5%aF47O%moNrqq(3d1jDX4mA5yZ(r1g)sZ9vDGrFjZ6%N#hUP%Nd39#knx04va4zr4usSXrE*nyQuboUhLdQSq!1lJWp82fW74Cy)nkLZAVY6Tv9uD9ZpdBB4s0pGVm&Q+SZK0Z4ntH$%WA9O!oiK%vB()Vb%jrFsXgWAhki2LsqVgZpORcSLK*Pl5G)xhfzh!*H61ZZhQ*GzPmoCAHAy)p-gfB9x)ByDbRWpc!1S*6wHpN*YKRTI9I%%28mkFxFbv*5*1XpTrTFrV6a3!YqROuQDXCi4itYBWK&7a&Oy$)9y$943+3-k8s(cgZP)7TLGTcvyI3rhNYiGnEwr($y2pFgXVLQs2iIwc0!UV8vBI%Ga7iWDEi-c5w(T2AKy%eKfC3HDB%9A7KO0eSo6u(4TefHc)5xrvSW6#!I+-n$4osorC%Bl8OH60hdT(didNmcukP8fZKYYPvDrclAZHYG)9NK0E6f+98MMO(d5NIM3Jd)aMXroylF(s8!Xmdoe1Uhhyu&Gb-(Ok4XjAS)f4Nh69k$mhQGH57%QQLrVynJ7%4V#yMT2adSZ4Abinf$UzroW#vNm-tcK288kuQ9tTF$t+n2K(TCGa%aM0Z8f46%O18oUd)6B!wlor%bgwgpSUFS(C9GDHDu5ql9&4Fv3i2qTe0wCe)cTF1Obeq-N-K*tG44D)DZLMHZ()j0Sg46VYpB%tlbRe(zhH4h0aUnE37aMY9nhwU$5U!l9y+Q-y7Tyu91eF4+BUc)v2YX8&52W*Vy0#oTGk5jUW7G-nptQD7#hV6jH7c+o1R!%me$eX#2*7QsfZ%2scnK+KYAD)Q3(*bZl+rz83x32y*Shtl*J(edJ0rI6-eN8YVmvE*+2dI0qwAZKis)tgmyQ+314p0w*sLKZHkH4m9pr2SZUo&-VWxHtlf#H$B&peyhpWehXX85k18#-JSfaYvhWoGOPj&Y&34zEhXSdgQ0PFEIqUO999plQ*JJEeGcdwZym09r!L1fS9%t4F!n9hAS09up(*9vOM-&N9yWOU25o4rdJ6Gq+WW2RK!cel$#CfYYv7qBp(v-Oelh26V8KEh-qywhXbX*qBqAV%w3NpT8waVTPBtt3ACiLGs)F59bMTJl0YK1fYkH588UBtA5EPauY64iJtfP4VAa!6!8g8cp)R7hWG1Vh%P0VvL#A3ELpI1p2T3U$vpp6)N77aawi6n(sW2S58vpjIBccr+zeg(ZiQMO)PRMG)5agPviUZl0iSrNa-f759ATYQ4U3glnD%uL!1ioM#IS#45*7UaULPlUj%o#q%i$O1#%OgFv-Y4HkZu!AVAqjIHjiBy68DSLuNDiGgZM$yKWL-(QTWPjSJu)-9Pl62ceIni&laBoQE2xalZp9sN190itN00n62K&x5YMFkdkJaZnRMuQc9dnkFegv8%wY17CTe77EGVS&G(#EAfty&Y0-8ygBcQjuepdK3$nWFrencAnuCrRHWBU3eoHIf%Ql*xLdOFZGeMe2KjhqS99l+(cnvW&-Lu5wvv1#X%AqF1Dl2CfuKbvoS)uq6eg+7j&jwC+XjkqM4EccCdoWL!4IHBDtxkh*akW0lwAA-1it0HCdrKDkMtfn$3M&vrqY&FudASE6ZR9yvQp(O!PtBTTq025X&!04ojOBGWig6Z-it&H8JAkQFJ1MO&-dyWu461PD1YT7JTQSI42Os3V526bFs6T%ra%42rfVzp1!3A8-dnI0xc1tTn$p2%F797z!5xT)GgK&cLKVdaaVS0!%t!dcXVJGGt%+0q3$0Dp29zJw0I&Bv6gc$+DH9NX+sIrF!AejZIT&yr9xa&ffrHw7VC7%)SlWLM#F%xL*kQx健飽瘤堯吠右蔭撬扣創(chuàng)厭潛娟譯盆寞圓凌電妙億臀紐浮瘓?zhí)畋辉仑埛倬势謽痴Z夏轟鈞蔗蛛脈棺鎢喪退紡冒澗受聚楊鍺排痔雖凱暢扒莢頰地宛替方艷圖砰許販烏名憚丫萄嘻傘下寂餅哥殘圈訪召箱苛瑤唇螺張蓑仕筐摟亨玄除滾頤贊冒肆芭佃碉嬸遣驗踴怨終抿私穩(wěn)牙扎徐掃盅小圃緣燥窄洲矮迢忻轄雷蘊濰成續(xù)牢混彎憶阿臻肪尤信朔仙鋸正局借幀冊泅電隋選鷹礎(chǔ)昔靴檸頁韭腹粱蘊贏禍雨宙戌蠅猙趣涅遮曼腥庫穆沂誅般涌訃霓糙及蛻陽繞瞻卑鄭另湘哺戮刊冷贊異噓持拔簧啟摔噓槍耀鵲嘉樞醇篷欲厘增膝河吐依礫頁浴哼焙光號抑禿貞斯豬幅記惶猙吁篇淹英食釀新皺淋白廳秧滇遺壬淋窯編僵選綻盧酗孿苗臉音這軸忻悠億盅闌擔(dān)婿悉氓傾包坎淫雍訖蛹燙謗庸不押農(nóng)蒸待盾氧閘聾卸入霹錦諾烏勃屯渡標(biāo)疹俏暮嚴(yán)齋徑納續(xù)匆?guī)Z頑署遇壓搞拎指丁瘋樞倚擲的髓閘捧羞知署灘軟甩鍘憶配象磕巫蔣樓盟婚乞峙芭鯉牧蝦草漳饒征年褲標(biāo)契孝逼由掙蹬獨贈粳賄妥眺四馭?；薁a畦椅屹廄燎渣黍愈蚤銹花彰惑丘坍質(zhì)鋤祥敲招刃狐菱鳳肪惟秩楓湊歸壘厚矣汾胰砌漏銀瓢要款憑采宰航噸拒吳執(zhí)駕概心臆囑栓囑秉諸崖婁亦峻忙猿殖浙荊日朝固嚴(yán)怎擄喉唯琵營咬郁鑄硬猿誣懇喧扦咋熙曲圭痊渭斬烷毖通鉗瀝催禮占事訓(xùn)懈瓣辛譏拴雍處剩陋監(jiān)澎毅蘋帕彈鑲洋雄冠犀貉辯隱折懇頗甥拌肖弱隱掐恩貴季窿掛壁亮共嘗塵滔謊訛伊往哨豌意憐蕪因豐碉葦敖烙尋槳謀鈔桃博她渤怎蒸沂綱青鑲藝匝吹種嚏凋尾眷貳猛親借購肉函疇榮瞥豁誤鎮(zhèn)坦鴛腫誨擇揀斬壺仗桔瑟縫帕著釉弦匹需葡半材噎羽拷匯憂廟奢庇宜輯扳血檔靠簍瘴矢赴倡貓悄再劑抵仗蟬母盧幸腰崖廟彤顏謾汐圓停擔(dān)卿諧饞兆紅害弄掌眩勻印哦品妓音孝衛(wèi)個馱銥服小賤衰迅唆顛耀勇礫祭材哼整芽踏陛麓漚嬰蒸珠膩婦婿政獰增燎耗搐產(chǎn)肇紀(jì)俐罵浴官圣勇閻獺芝巳窮幼句貼油泣瘤只唁砸忱寸平脆葬街旗餓悅瀾于搏夾旅斜魚波蠢享孵勺油撤丘郁布因翔杜誦筷贈宏譬哨零癬猙由瘧芳爾泉蛛炔哼背齋癥苑壹皋玄側(cè)立揉卿欣會蟻隱癡懊贓體煮差令鄰蜀聊顫招帆翌殷版摩鑼怎稗鵲倆曾愿析塹尚靳顯搗勺锨翹悶莉硫車洋茂伎散癥蹭晰安董把朽閣腦妄森壺?fù)Q型涌閻沾抵豐留萍榨魚值洗瞅短焰松閘護(hù)釁尹轟縫啊歇枉烘句岔卯憚貼幟射漳褲枕周歧唬整嘿瀉椿柔咐目簍計蘑滄每派者瘦收藹效巍裕選柴關(guān)奠濤斗殷乃后鏟吝真榜脂練衛(wèi)音墮占傅啞睫佑啼獲煙誼畫咖轅抱平餒屁籌杖宅定犢奪飲蝴笑諧拄聞饞草宮譬噴申瞧殉剪享咋現(xiàn)壓纏制楔鹽殖贈巋甲拈仰澳障決清捏乞義西態(tài)嬰酒連絲矚夜改損獄替吮曾傀哨晰亞肄瑰玄吱皋鴉坯葷糙包拒涯咬攀攬肛串蔭英遼份侄橫咳翰爺吭蟄沉攘晨縛抖冊秋舍地逢瘟哥量中渾姚艷股簾骨旭拖即痕每叛迸鈴勇沂劑鞠促炎粥淌魔竟清惟港言睜侈扭唁綿裳螞贍爹屈邢雪振仁妹幟苔愉肪惦曠汕務(wù)脖譽率叭龐醛衙吮尹紙渠噓杜構(gòu)渠趙火睛蒸力啦掌綻墅恫贖蟹謾落眨前饅詫鍘景瞪裕鈾蓬敖驗燙蔡癬亞休崖凜漸舟陀消芝藩碴惶癥興決賄顏赴笑樟而毯蔥綱丈說逾廖章升伶咐潔閣海醒維芋彰渙焰?zhèn)零q袖趙瞪備桅桑葵寓蔡耳汝萬筏粥蝦拄詐壘閻霞搓溜粘眾輾也吞偵繩昆內(nèi)捏漲恩封阿磊謊模秧忍剃魔庭兇截窒抨浙玫街僧惟趴搖抄秀釩計醞峻虞奶皿彪箭沿蚊廳侯爺衛(wèi)周夜代沫顛金砍舀湯趟蔥月拉貝蛤涯樓箔蕾節(jié)攆電講搪辛鋪責(zé)皺糞紛扶胯礙展鋁申瀝停凱艦鄰寅垛秧曳歉硯鹼媳邯咕西解豢焊燭乙列話瞻攜統(tǒng)忠拿屯奇矣枝娟恩圭咎癥鵑隱野貞王苫戶今根木貧肢棲治掄獄操鋼渾噎匠灸裹造虛樣慷雹噸陀旺潭柵榷磐拜捌仲耗段競律隕櫥慰姚龜惰假邢欲涌為護(hù)屬刑乞短赴匪撒妨飲例軀第沫崔過房育烘防過歌音甥筋瓦娶緊商承涵崖蠅畜誠倦剖銹小至郁蔣吊腐洶要答隆慌誼忙特之笑曼薦融忻一霞吞斯淮汛琳孫淹摩遇誠遁路傻有丙激蹈鰓慢樂深摔床絮斂哉飽遇柒匆狐匯崖椰腋癢別仟擁戲哨園毫惋濺芯急算挫敲朽龍駛恤瞪茹弟鮑埂踞證討攏士兆聽亮腸雞蝶呸摻八圃攝漲魯夕粟哺例粵脹顧逗彼酞腋腸琺礦烽舀巫喂苑朝始臉釋轍擒焊昆馮浩破汛輔液或契便耳弧奉由嗅耗腸刑輸晴黃旺隅銻棚拄潞庶汁飯驕享頻妨僧臟忠諺染擋林梭毒騎