生物選修一大腸桿菌的培養(yǎng)和分離

1-1什么是生物技術(shù)生物技術(shù)=生物工程應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)原理，以微生物體、動(dòng)物體、植物體或其組成局部作為生物反響器將物料進(jìn)行加工，以提供產(chǎn)品來(lái)為社會(huì)效勞的技術(shù)。1-2傳統(tǒng)生物技術(shù)傳統(tǒng)生物技術(shù)指主要通過(guò)微生物的發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)商品.如:醬、醋、酒、面包、奶酪、酸奶等1-3現(xiàn)代生物技術(shù)一般而言，現(xiàn)代生物技術(shù)可以分成以下五種：一、細(xì)胞工程二、發(fā)酵工程 三、蛋白質(zhì)工程四、酶工程五、基因工程

現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)生物技術(shù)的本質(zhì)區(qū)別是現(xiàn)代生物技術(shù)中用到了基因工程。

一、細(xì)胞工程

按照人們的需要和科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳根底，并通過(guò)細(xì)胞(組織)培養(yǎng)，細(xì)胞雜交(融合)，核移植和胚胎移植等技術(shù)，重組細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和內(nèi)含物，以改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，快速繁殖和培養(yǎng)出人們所需要的新物種的生物工程技術(shù)。二、發(fā)酵工程

微生物的無(wú)氧呼吸叫發(fā)酵1.定義：利用DNA重組技術(shù)對(duì)不同生物的遺傳基因，根據(jù)人們的意愿，進(jìn)行基因的切割、拼接及重新組合，再轉(zhuǎn)入生物體內(nèi)，產(chǎn)生出人們所期望的產(chǎn)物或創(chuàng)造出具有新的遺傳特征的生物類型。蛋白質(zhì)工程主要包括了解合成蛋白質(zhì)的DNA編碼序列、蛋白質(zhì)的別離純化、蛋白質(zhì)的序列分析和結(jié)構(gòu)功能分析、蛋白質(zhì)結(jié)晶和結(jié)構(gòu)力學(xué)分析等。三、蛋白質(zhì)工程

酶工程即利用基因工程等手段，改變酶或蛋白質(zhì)的折疊方式、空間結(jié)構(gòu)、催化活性和穩(wěn)定性等四、酶工程選修1需學(xué)習(xí)的實(shí)驗(yàn)〔微生物的利用〕實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和別離〔酶的應(yīng)用〕實(shí)驗(yàn)4果汁中的果膠和果膠酶實(shí)驗(yàn)5加酶洗衣粉的使用條件和效果實(shí)驗(yàn)6α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測(cè)〔生物工程在食品加工中的應(yīng)用〕實(shí)驗(yàn)8果酒及果醋的制作實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)10泡菜的腌制和亞硝酸鹽的測(cè)定〔淺嘗現(xiàn)代生物工程〕實(shí)驗(yàn)11植物的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第一局部:微生物的利用一、根底知識(shí)1微生物2培養(yǎng)基3無(wú)菌技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)操作2微生物的接種技術(shù)1操作步驟微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌和藍(lán)細(xì)菌放線菌真菌原生動(dòng)植物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu).原核生物界原生生物界真菌界病毒界一根底知識(shí)〔一〕微生物細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌：?jiǎn)渭?xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色〔革蘭氏染色〕后顯微鏡觀察A.球菌B.桿菌C.弧菌革蘭氏染色革蘭氏染色是一種用于細(xì)菌的染色法。革蘭氏陽(yáng)性菌革蘭氏陰性菌用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細(xì)菌仍保存染色液的顏色相反細(xì)菌的構(gòu)造圖細(xì)菌的結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜擬核細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌〔纖〕毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、擬核，細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲(chǔ)存性顆粒、核質(zhì)等。*細(xì)胞壁成分：肽聚糖細(xì)胞壁有哪些功能？①固定細(xì)胞外形；

②保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷；

③阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；④使細(xì)胞具有致病性及對(duì)噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時(shí)以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜〔如溫度、水分適宜〕的時(shí)候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個(gè)細(xì)菌.菌落：?jiǎn)蝹€(gè)或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，就會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)碳源

有機(jī)、無(wú)機(jī) 氮源

有機(jī)、無(wú)機(jī)水無(wú)機(jī)鹽生長(zhǎng)因子即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶大腸桿菌的培養(yǎng)與別離實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作2.進(jìn)行大腸桿菌的別離,用固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的劃線培養(yǎng)3.說(shuō)明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理A.球菌B.桿菌C.弧菌對(duì)鏈霉素敏感大腸桿菌根底知識(shí)：由于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同，細(xì)菌可分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。革蘭氏陽(yáng)性菌：革蘭氏陰性菌：細(xì)胞壁厚，無(wú)莢膜，多產(chǎn)生外毒素。對(duì)青霉素更為敏感。細(xì)胞壁薄，有莢膜，多產(chǎn)生內(nèi)毒素大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，異養(yǎng)兼性厭氧型腸道桿菌。在腸道對(duì)人無(wú)害，但進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)便會(huì)產(chǎn)生危害。大腸桿菌在基因工程中廣泛應(yīng)用，它的質(zhì)粒是最常用的載體，也是基因工程中常用的受體細(xì)胞。大腸桿菌的培養(yǎng)和別離菌種保存培養(yǎng)基的配制滅菌超凈工作臺(tái)倒平板接種液體培養(yǎng)別離培養(yǎng)氮源

礦質(zhì)元素生長(zhǎng)因子

能源碳源水

培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。大腸桿菌培養(yǎng)基：一般用LB液體培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線別離。一、大腸桿菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基種類液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基物理狀態(tài)01選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基目的用途化學(xué)成分02合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基03液體培養(yǎng)基：外表生長(zhǎng)均勻混濁生長(zhǎng)沉淀生長(zhǎng)按物理狀態(tài)來(lái)分用途：工業(yè)生產(chǎn)、擴(kuò)大培養(yǎng)固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔按物理狀態(tài)來(lái)分用途：菌種別離、鑒定、計(jì)數(shù)保存菌種半固體培養(yǎng)基：無(wú)動(dòng)力有動(dòng)力(彌散)觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、厭氧菌的別離和菌種鑒定按物理狀態(tài)來(lái)分1．液體根底培養(yǎng)基牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化鈉0.5g，蒸餾水100ml，加熱溶解以上成分，冷至40-50℃，調(diào)pH值至7.4~7.6，煮沸3-5分鐘，補(bǔ)足水分，過(guò)濾、分裝、高壓滅菌。2．半固體根底培養(yǎng)基在液體根底培養(yǎng)基100ml中加瓊脂，加熱至100℃使瓊脂熔化，分裝試管，高壓滅菌。取出后直立放置至瓊脂凝固。3．固體根底培養(yǎng)基在液體根底培養(yǎng)基100ml中加瓊脂2-3g，加熱至100℃使瓊脂化，分裝于試管和三角燒瓶中，高壓滅菌。取出后趁熱將試管傾斜一定角度放置，瓊脂凝固后即成普通瓊脂斜面；將三角燒瓶中培養(yǎng)基傾注于滅菌平皿內(nèi)，凝固后即成瓊脂平板根底培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基參加青霉素的培養(yǎng)基:別離酵母菌、霉菌等真菌參加高濃度食鹽的培養(yǎng)基:別離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基:別離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基:別離自養(yǎng)型微生物參加青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:別離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞按功能來(lái)分——添加或缺少某種化學(xué)成分用于菌種的別離鑒別培養(yǎng)基按功能來(lái)分當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時(shí)細(xì)菌帶正電荷被染成紅色，再與美藍(lán)結(jié)合形成紫黑色菌落，并帶有綠色金屬光澤。常用的伊紅美藍(lán)乳糖培養(yǎng)基，可用來(lái)鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細(xì)菌添加某種指示劑后化學(xué)藥劑用于菌種的鑒別伊紅—美藍(lán)鑒別大腸桿菌大腸桿菌菌落伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液〔如雞胚和牛胚浸液〕。優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限;成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：按化學(xué)成分來(lái)分根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定;本錢低缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。合成培養(yǎng)基:按化學(xué)成分來(lái)分血清中含有：①多種蛋白質(zhì)〔白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等〕②多種金屬離子；③激素；④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基〔如血清〕。按化學(xué)成分來(lái)分不同的微生物往往需要采用不同的培養(yǎng)基配方不管哪種培養(yǎng)基，一般都含有水、碳源、和氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子(即細(xì)菌生長(zhǎng)必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、氧氣、滲透壓的要求．細(xì)菌喜葷，霉菌喜素大腸桿菌配方：酵母提取物：0.5g蛋白胨：0.5gNacl：0.5g瓊脂

：1g水:50ml細(xì)菌喜中性偏堿，霉菌喜中性偏酸LB固體培養(yǎng)基大腸桿菌菌液〔LB液體培養(yǎng)基〕大腸桿菌培養(yǎng)基：一般用LB液體培養(yǎng)基來(lái)擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線別離。大腸桿菌的擴(kuò)大培養(yǎng)好氧型將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床培養(yǎng)12小時(shí)。本卷須知:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻前方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復(fù)原.二、無(wú)菌技術(shù)從制備培養(yǎng)基到接種與培養(yǎng)等全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程要無(wú)菌操作〔1〕對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；〔2〕將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；〔3〕為防止周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行；〔4〕防止已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。獲得純潔培養(yǎng)物的關(guān)鍵:

消毒與滅菌

(1)消毒：概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體外表或內(nèi)部一局部對(duì)人體有害的微生物。包括芽孢和孢子嗎？不包括防止外來(lái)雜菌的入侵1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min〔日常生活常用〕2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min〔對(duì)一些不耐高溫的液體，常用于鮮奶的消毒〕

3、化學(xué)藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進(jìn)行皮膚消毒;氯氣消毒水源〔雙手使用酒精消毒〕4、紫外線消毒消毒的方法：對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑碳酸和煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后用紫外線進(jìn)行物理消毒〔2〕滅菌概念：使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a

灼燒滅菌b干熱滅菌c

高壓蒸汽滅菌a灼燒滅菌微生物的接種工具(接種環(huán)、接種針)或其他金屬用具直接在火焰的充分燃燒層灼燒b干熱滅菌

160－170℃；1－2h能耐高溫的需要保持枯燥的物品(玻璃器皿)C高壓蒸汽滅菌

100kPa121℃15-30min通常用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水的滅菌補(bǔ)充：外表滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時(shí)可以根本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。而培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設(shè)計(jì)的。培養(yǎng)基滅菌★根底培養(yǎng)基：121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘★含糖培養(yǎng)基：90℃以上滅菌30分鐘★雞蛋、血清培養(yǎng)基：間歇滅菌3天3次★不耐高溫的液體成分：

G6玻璃砂漏斗濾過(guò)除菌細(xì)菌檢驗(yàn)的操作需在無(wú)菌室或超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。無(wú)菌室、超凈工作臺(tái)使用前后需進(jìn)行消毒。細(xì)菌檢驗(yàn)使用的物品使用前后需嚴(yán)格滅菌標(biāo)本的采集無(wú)菌試管、燒瓶的使用3.無(wú)菌環(huán)境4.接種前準(zhǔn)備用肥皂洗手并使用酒精消毒。點(diǎn)燃酒精燈→酒精棉擦拭雙手→酒精棉擦拭桌面1.無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？2.請(qǐng)你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請(qǐng)選擇適宜的方法?！?〕培養(yǎng)細(xì)菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿〔2〕玻棒、試管、燒瓶和吸管〔3〕實(shí)驗(yàn)操作者的雙手答：無(wú)菌技術(shù)還能有效防止操作者自身被微生物感染。答：〔1〕、〔2〕需要滅菌；〔3〕需要消毒。思考1配制培養(yǎng)基包器材滅菌菌種擴(kuò)增倒平板接種、劃線培養(yǎng)觀察記錄實(shí)驗(yàn)流程三、大腸桿菌的別離倒平板接種、劃線灼燒接種環(huán)→取菌液→劃線別離燒至暗紅接種、劃線灼燒接種環(huán)→取菌液→劃線別離菌液膜接種、劃線1、劃線別離法為什么通過(guò)劃線別離可得到單菌落？每劃完一個(gè)區(qū)域要不要灼燒接種環(huán)？①④③②一旦劃破，會(huì)造成劃線不均勻，難以達(dá)到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個(gè)細(xì)胞無(wú)法形成規(guī)矩的菌落，菌落會(huì)沿著劃破處生長(zhǎng)，會(huì)形成一個(gè)條狀的菌落。恒溫培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中的水分會(huì)以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會(huì)使水蒸氣凝結(jié)成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會(huì)落入培養(yǎng)基表面并擴(kuò)散開(kāi)。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會(huì)導(dǎo)致菌隨水?dāng)U散，很難再分成單菌落，達(dá)不到分離目的。(1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操