我國蟲媒病毒研究進展

我國蟲媒病毒研究進展

動物疾病是由吸血動物引起的疾病，通過吸收血液、動物疾病傳播疾病。其特點是病毒在節(jié)肢動物體內(nèi)繁殖,但是動物自身卻不發(fā)病。蟲媒病毒性疾病大多數(shù)是自然疫源性疾病,由于節(jié)肢動物叮咬人、畜引起疾病,因此蟲媒病毒屬于人畜共患病毒。蟲媒病毒是近幾10年發(fā)展較快的一組病毒,1950年全世界只發(fā)現(xiàn)35種蟲媒病毒,1992年在國際蟲媒病毒中心登記的蟲媒病毒已經(jīng)達到535種。其中128種證明對人畜致病。我國到目前已證實4種蟲媒病毒在我國的存在與流行,它們是乙型腦炎病毒(JapaneseEncephaitisVirus,JEV)、森林腦炎或春夏季腦炎病毒(Spring-SummerEncephalitisVirus,SSEV)、新疆出血熱病毒(XinjiangHaemonhagicFeverVirus,XHFV)、登革熱病毒(DengueFeverVirus,DFV)1-4血清型。我國蟲媒病毒研究雖然起步晚,但是發(fā)展較快。特別是近10年來不但又分離到一些新病毒,而且開始結(jié)合血清學和分子生物學對新分離的和原有的病毒進行了系統(tǒng)的鑒定,使我國的蟲媒病毒研究工作得到了快速發(fā)展。將我國蟲媒病毒10年來的研究進展作一綜述。1病毒的分離和鑒定自1990年來,我國分別在新疆、海南、山東、煙臺等省市分離到多株披膜病毒甲病毒屬、呼腸弧病毒科Colti病毒屬病毒。另外,對以前分離但未確定的病毒進行了鑒定工作(表1),總結(jié)了近10年來分離和鑒定的病毒背景以及其基本生物學特性。1.2Colti病毒屬我國近十年來從蚊子中分離了多株Colti病毒,而分離的毒株與歐美流行株之間在核苷酸序列、氨基酸序列存在差異,在流行病學、致病性以及血清學等方面也存在較大差異。由于我國Colti病毒都是從蚊子中分離的,病毒對人的致病性目前并不清楚。2昆蟲媒毒癥的生物學研究2.1病毒的分離和鑒定病毒全基因組核苷酸序列測定和分析可以闡明已經(jīng)分離的病毒基因組與病毒標準株、國外流行株之間的基因型差異,從而分析病毒的來源、確定病毒分類及在此基礎(chǔ)上進行病毒致病的分子生物學研究,為蟲媒病毒性疾病的預防和控制提供理論依據(jù)。2.1.1XJ-160毒株是我國首次分離的辛德畢斯病毒,其血清學實驗顯示,病毒與標準甲病毒的抗體反應陽性,中和試驗證實為甲病毒屬辛德畢斯病毒。李蕾等對病毒的全基因組核苷酸序列測定與分析顯示病毒全基因組全長11626個核苷酸,編碼3731個氨基酸?；蚪M編碼四種非結(jié)構(gòu)蛋白和3種結(jié)構(gòu)蛋白和2個小分子肽。核苷酸序列分析表明,XJ-160病毒具備典型的甲病毒屬辛德畢斯病毒基因組特征,與標準辛德畢斯病毒(AR339病毒株)相比核苷酸序列存在18%差異,氨基酸差異為8%,提示我國分離株為該類病毒的新亞型。這是我國首次完成的此類病毒的全基因組序列分析。2.1.2YN87448毒株是從云南一位發(fā)熱病人血清中分離的甲病毒,周國林等對病毒的全基因組核苷序列測定與分析結(jié)果顯示YN87448毒株結(jié)構(gòu)區(qū)基因序列長度為4059個核苷酸,非結(jié)構(gòu)區(qū)基因序列長度為7613核苷酸。與辛德畢斯病毒家族中神經(jīng)毒性最強、唯一能致成年小鼠死亡的S.A.AR86株的核苷酸序列同源性為98.8%,但是YN87448毒株不致成年小鼠死亡。此工作不但明確鑒定了YN87448毒株是辛德畢斯病毒,而且明確了其分類地位,從分子水平揭示了其與病毒標準株的差異。2.1.3XJ-90260毒株血清學鑒定為甲病毒,呂新軍等對病毒進行分子生物學鑒定,結(jié)果顯示病毒基因組3′非編碼區(qū)核苷酸序列中包含兩個重復序列,該重復序列的核苷酸順序及重復次數(shù)具有典型的西方馬腦炎病毒的特征。通過序列同源性分析顯示XJ-90260病毒株與已知的西方馬腦炎病毒株序列同源性都超過93%,系統(tǒng)進化樹分析顯示與德克薩斯分離株(TBT)和俄羅斯分離株(Y62-33)的進化關(guān)系最近。這是西方馬腦炎病毒在我國的首次報道。我國9省區(qū)的886份血清做流行病學調(diào)查顯示為該病毒抗體陽性血清24份,陽性率為2.71%。西方馬腦炎病毒的分離對我國疾病控制有重要的流行病學意義,因為自從美國9.11事件、炭疽傳播事件之后,作為世界公認的生物戰(zhàn)劑之一西方馬腦炎病毒在我國成功分離將為建立病毒的快速、準確的診斷方法,制備病毒疫苗等工作奠定了基礎(chǔ),為我國制定預防和控制相關(guān)的生物恐怖事件的措施提供了參考。2.1.4M-1毒株、HBb17毒株血清學鑒定為甲病毒,趙文忠等將HBb17和M1毒株的3′末端和結(jié)構(gòu)基因的E1區(qū)序列的核苷酸序進行測定,結(jié)果顯示,在3′末端非翻譯區(qū)HBb17病毒與羅斯河病毒(國際標準株T48病毒)核苷酸同源性為99%,結(jié)構(gòu)基因的E1區(qū)序列與羅斯河病毒核苷酸(氨基酸)同源性為99%(99%);M1病毒在3′末端非翻譯區(qū)與鷺山病毒同源性為98%,結(jié)構(gòu)基因的E1區(qū)序列與鷺山病毒核苷酸(氨基酸)同源性為97%(99%),與蓋塔病毒同源性為94%(98%)。序列分析表明,海南島分離的HBb17病毒屬于羅斯河病毒,M1病毒可能是鷺山病毒或蓋塔病毒的變異株。2.2全基因組核苷酸測序結(jié)果及免疫原性改變乙型腦炎病毒引起嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,SA14-14-2減毒活疫苗株在我國累計接種1億人,其安全性和預防效果已得到充分的證實。但是我們也看到一些已經(jīng)接種疫苗的人仍患病,面對這一現(xiàn)象從毒株的免疫原性上考慮,開展了這一毒株的基因組全序列測定,從核苷酸突變位點上分析減毒機制和免疫原性的改變。全基因組核苷酸序列測定與分析結(jié)果顯示毒株全基因組全長10976個核苷酸,96到10394為一個長開放讀碼框,編碼3432個氨基酸。突變位點分散于各個區(qū)域,7個可能與減毒相關(guān)的位點均未發(fā)生改變,1296～1506間有4個突變位點,可能作為疫苗質(zhì)控的遺傳學標記。測定這株病毒全基因序列的意義在于可以在此基礎(chǔ)上進行基因組結(jié)構(gòu)與疫苗減毒機制的關(guān)系研究,同時為疫苗生產(chǎn)的遺傳學質(zhì)控標準的研究奠定基礎(chǔ)。2.3全基因序列測定登革熱病毒分4個血清型,我國科研工作者對2型登革病毒NS1基因、NS3全基因以及4型登革病毒E基因均做過cDNA克隆和堿基序列的測定和分析。對登革2型病毒(D2-04株)基因組全序列進行了測定,這是我國首次對登革病毒進行的全基因序列測定,結(jié)果表明,D2-04株基因組全長10723個核苷酸,同源性比較顯示與JAM株類似(97.6%)。之后對登革2型兩株病毒(D2-43株、D2-44株)基因組的全序列進行了測定。并對1999年在福建省登革熱流行時的病人血清中分離的登革2型一株病毒(FJ-10株)進行基因組全序列測定。結(jié)果顯示,FJ-1Q株基因組全長10723個核苷酸,有1個開放讀碼框(OPF,第97-10,269nt),編碼3,391個氨基酸,5′和3′非編碼區(qū)長度分別為96和454個核苷酸。以登革2型病毒E/NS1連接區(qū)240個核苷酸序列進行系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示,福建株與印度尼西亞和斯里蘭卡分離株親緣關(guān)系較近,同屬于第Ⅳ基因型。2.4nsp2基因與誘導細胞凋亡的關(guān)系張小青等在描述辛德畢斯病毒誘導BHK-21細胞凋亡的過程基礎(chǔ)上將一段病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsP2基因克隆到真核表達載體pMAMneo中,瞬間表達后檢測細胞,發(fā)現(xiàn)其中一些細胞中出現(xiàn)DNA斷裂,這是細胞凋亡的基本指標,從而推測nsP2基因與誘導細胞凋亡相關(guān)。李蕾等構(gòu)建了辛德畢斯病毒(XJ-160病毒株)結(jié)構(gòu)蛋白基因的真核表達質(zhì)粒,pcDNA3.1ABC,轉(zhuǎn)染BHK-21細胞,觀察發(fā)現(xiàn)宿主細胞出現(xiàn)細胞毒性反應,表現(xiàn)為:細胞存活率降低;細胞核染色質(zhì)濃縮、凝集;G1期細胞減少、而處于S期的細胞增多,從而證明完整辛德畢斯病毒結(jié)構(gòu)基因可以引起細胞凋亡。2.5病毒的結(jié)構(gòu)鑒定和pcr檢測相對于血清學診斷,分子生物學診斷更加快速、靈敏、檢出率和準確性更高。我國在近10年加速了這方面的研究工作,主要的研究進展體現(xiàn)在甲病毒和黃病毒分子生物學鑒定方法的建立。甲病毒基因組分為非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)。甲病毒在結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)終止子以后到3′末端多聚腺甘酸尾(polyA)以前為3′UTR,此區(qū)間均有40～60個核苷酸的重復序列。但不同的甲病毒3′UTR中重復序列(RSE)的長度、堿基排列順序、RSE間的距離或RSE距終止密碼子的距離以及RSE的類型、數(shù)量均各不相同,而相同甲病毒3′UTR中的RSE則比較保守,因此3′UTR可作為甲病毒分子生物學鑒定的依據(jù),我們實驗室采用這一方法對分離的XJ-160、YN87448、XJ-90260、XJ-91006、M-1、HBb17等病毒株進行了分子生物學鑒定獲得了病毒確切的分類結(jié)果。為了早期快速診斷黃病毒感染,方美玉等人在我國建立了黃病毒科病毒的PCR檢測方法。首先在黃病毒的NS1基因序列設(shè)計了一對通用引物,擴增序列長度是413bp,同時在登革病毒(DEN)1,2,3,4型和乙型腦炎病毒(JEV)設(shè)計了各病毒的內(nèi)引物。應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)成功擴增了DEN1-4型和JEV基因部分片段,并且應用套式PCR的方法對臨床診斷為登革熱和乙型腦炎患者的血標本進行了檢測。結(jié)果表明,該方法能直接檢測發(fā)病患者早期血標本中的病毒基因,并且在2天內(nèi)完成對黃病毒的鑒別診斷。此方法不但可以檢測黃病毒科的病毒,而且還可以特異性地診斷乙腦病毒、登革熱病毒,更可貴的是該方法可以對登革熱的4個血清型病毒加以區(qū)分。上述方法的建立除了在基礎(chǔ)科研水平上的意義之外,更重要的意義在于從分子生物學水平證實我國有引起發(fā)熱、皮疹、腦炎的新病原體的存在,同時也為建立臨床上適用的快速、準確的診斷方法提供了基礎(chǔ)。3中國昆蟲傳播疾病的研究3.1離到的蟲媒病毒的形態(tài)我國地域廣闊,地理條件復雜,地跨熱、溫、寒三帶,生物種類繁多,存在著多種蟲媒病毒的傳播媒介,但是我國目前分離、鑒定的蟲媒病毒的種類少,與我國的實情不符。例如布尼亞病毒科的病毒在260種以上,占蟲媒病毒總量的一半左右,而我國目前僅發(fā)現(xiàn)一種(新疆出血熱)。目前分離到的蟲媒病毒主要屬于披膜病毒科甲病毒屬和黃病毒科,今后的工作除了繼續(xù)在蚊、蜱等常見的媒介分離病毒外,應該加強從稀有的媒介昆蟲中分離病毒。例如,白蛉可以傳播白蛉熱病毒,我國有30種白蛉,很可能存在白蛉熱病毒的流行。白蛉熱病毒常與黑熱病并存,因此應該加強甘肅省、陜西省、新疆等我國黑熱病區(qū)的白蛉熱病毒的研究。近幾年我國分離到一些蟲媒病毒,少數(shù)已經(jīng)定種,其它的限于各種原因沒有確定其分類地位,下一步我們應盡快地對這些病毒加以鑒定。除了未知病毒潛在的危險性之外,一些新分離的蟲媒病毒如:辛德畢斯病毒、基孔肯雅病毒、colti病毒、西方馬腦炎病毒等,由于分離年代較短,基礎(chǔ)研究較差,其人群中致病性還不清楚,同樣存在潛在的危險性。其中有首次從發(fā)熱病人血清中分離的甲病毒屬辛德畢斯樣病毒(YN-87448),說明此類病毒可能在我國人群中流行。所以應盡快在我國的人群中進行調(diào)查,從而證實這些病毒在我國的存在和流行。3.2建設(shè)病毒監(jiān)測系統(tǒng)的必要性蟲媒病毒性傳染病在歷史上曾經(jīng)嚴重威脅人類的生命和健康,現(xiàn)在在全世界許多地區(qū)仍有多種疾病流行。從我國1991～2001年十年的全國傳染病統(tǒng)計資料回顧可見,自然疫源及蟲媒傳染病死亡率占各種疾病的總死亡率的百分數(shù)均穩(wěn)定在30%～40%。國際形式變幻莫測,像美國遭受的生物恐怖襲擊所導致的損失是無法用金錢來衡量的。我國入世之后,國際貿(mào)易大量增加,使得許多病毒的傳播媒介甚至媒介種群發(fā)生移動,通過各種途徑進入我國。要防范一些別有用心的人利用病毒制作的生物武器來威脅我們國家,積極的保護我國人民的生命和財產(chǎn)的安全。我國目前正在大力開發(fā)西部,將有大量的人群遷入以前偏遠的地區(qū),可能會造成蟲媒病毒病的傳播、甚至爆發(fā)流行。因此,需要建立完善的、有效的、切實可行的蟲媒病毒和蟲媒病毒病的監(jiān)測系統(tǒng)。具體工作建議如下:(1)系統(tǒng)總結(jié)目前已經(jīng)確定存在和流行的四種蟲媒病毒和新分離的蟲媒病毒在全國的分布情況,這些病毒相應的媒介在我國的分布情況,具體內(nèi)容包括病毒的種類、分離到病毒的省份和時間、毒株的特性(基本生物學特性、分子生物學特性)、病毒的傳播媒介(長期宿主、擴增宿主)、媒介在分離地的生存背景,建立統(tǒng)計地圖加以直觀闡明。(2)分析多年的蟲媒病毒病的統(tǒng)計資料,找到各種疾病的發(fā)病規(guī)律,疾病對人群的危害程度,具體內(nèi)容包括疾病的種類、疾病常發(fā)季節(jié)、主要發(fā)病人群、疾病對人、畜的致死率。同時盡快地研究新分離的蟲媒病毒在我國人群中的致病情況。(3)根據(jù)不同病毒的情況在全國找若干地區(qū)建立監(jiān)測點,及時掌握每年病毒的變異情況,媒介的數(shù)量、疾病的發(fā)生情況。將資料上報疾病控制中心以便于全國的疾病監(jiān)測。3.3性抗體的檢測眾所周知,一種新的蟲媒病毒病的確認,既要分離到病毒,又要獲得病毒流行的血清學證實,這需要獲得病人急性期和恢復期血清特異性抗體存在4倍以上增長的證據(jù)。要獲得這些證據(jù)只有病毒基礎(chǔ)研究單位與醫(yī)院的通力合作,才能夠及時地、準確地收集到病人的腦脊液和/或雙份血清。現(xiàn)在我國在臨床上有很多不名熱、不名腦炎的病例,而這些疾病可能是由蟲媒病毒引起的,如果在臨床上加以重視,并且及時采集樣本送研究單位,將會促進我國