砂漿中汞的生物可接受性研究

砂漿中汞的生物可接受性研究

朱沙是皇家磺酸之一，主要含有硫化銀（hgs）。朱沙作為一種藥物在中國(guó)已有幾千年的歷史。近年來(lái)，一些科學(xué)家（長(zhǎng)期、超額過(guò)低、不規(guī)范）合理使用朱沙或復(fù)方制劑引起的副作用或慢性中毒的報(bào)道被報(bào)道。朱沙的藥物安全性受到高度重視。朱沙的主要化學(xué)成分，硫化銀（hgs）很難溶于水，也很難吸收進(jìn)入體內(nèi)。除了hbs外，一些可溶性藥物（hg2+）和游離汞（hg）也可以在水中溶解。胃腸道很容易被消化，這可能是其治療效果或毒性的真正來(lái)源。因此，整體重量法是用來(lái)評(píng)估朱沙和中藥中含砂量的安全性。研究朱沙中可利用的液體擴(kuò)散和排泄，對(duì)于評(píng)估朱沙的藥物安全性非常重要。作者采用外部消化透析法模擬人體胃腸道環(huán)境，測(cè)定朱沙中的液體受體，測(cè)定朱沙中的液體吸收和排泄規(guī)律，為臨床安全藥物的提供依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1實(shí)驗(yàn)儀器和試劑F732-S冷原子吸收光譜儀(上海華光儀器儀表廠),pHS-3C型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),ER-182A全自動(dòng)電子天平(十萬(wàn)分之一,日本A&D公司),Easypure純水系統(tǒng)(美國(guó)Barnstead公司),THZ-82型恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司).朱砂(成大方圓藥房),胃蛋白酶(活度1∶3000,美國(guó)華美生物工程公司),胰蛋白酶(活度1∶250,美國(guó)華美生物工程公司),豬膽鹽(BR試劑,北京市海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠),其他試劑均為分析純.透析袋(內(nèi)徑6.4mm,生工生物工程有限公司).實(shí)驗(yàn)用水均為超純水,所用的玻璃器皿經(jīng)15%HNO3浸泡24h,再用超純水洗凈.1.2外消化分析法測(cè)定了朱沙中鈣的生物可受刺激性1.2.1消化劑、食蛋白酶液、膽鹽的配制重鉻酸鉀溶液:稱取重鉻酸鉀0.1g,用5%硝酸溶解,并稀釋至1000mL.汞標(biāo)準(zhǔn)溶液:精密稱取HgCl20.1353g,至100mL容量瓶中,用重鉻酸鉀溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,得汞含量為1g/L的溶液.用重鉻酸鉀溶液稀釋,分別得到含汞5mg/L和0.05mg/L的溶液.吸收液:稱取高錳酸鉀3.16g,用超純水溶解并稀釋至1000mL,與1∶9硫酸溶液等體積混合.20%氯化亞錫溶液:稱取氯化亞錫10g,用1%硫酸溶解并稀釋至50mL(臨用前配制).人工胃液:取稀鹽酸(9.5%～10.5%)16.4mL,加去離子水定容至1000mL,即得.胃蛋白酶溶液:精密稱取胃蛋白酶1.6g,用人工胃液溶解并定容至10mL容量瓶中,得濃度為0.16g/mL的胃蛋白酶溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配.人工腸液:取磷酸二氫鉀6.8g,加水溶解,用0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8,去離子水稀釋至500mL,即得人工腸液.胰液-膽鹽(豬膽鹽)混合溶液:精密稱取胰蛋白酶0.18g、膽鹽1.75g,用人工腸液溶解并定容至50mL容量瓶中,得胰蛋白酶和膽鹽質(zhì)量濃度分別為3.6g/L和35g/L的胰液-膽鹽混合溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用.1.2.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密量取0.05mg/L汞標(biāo)準(zhǔn)溶液0(空白管)、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6mL置于10mL比色管中,用吸收液稀釋至5.0mL,向各管滴加20%鹽酸羥胺溶液1～2滴,振搖至高錳酸鉀的紫色褪盡,靜置20min.將比色管中溶液全部轉(zhuǎn)移至翻泡瓶中,再用0.5mL水清洗比色管,洗液一并倒入翻泡瓶中,分別加入20%氯化亞錫溶液1mL后立即與冷原子吸收光譜儀氣流系統(tǒng)聯(lián)接,并送入流量為1L/min的載氣(空氣),以空白管調(diào)零,讀取微安表所示最大讀數(shù).據(jù)汞的含量與最大讀數(shù)之間的關(guān)系,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.1.2.3腸吸收環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)胃消化環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn):精密稱取朱砂0.25g,加入人工胃液25mL,攪拌呈勻漿狀,加入胃蛋白酶溶液0.5mL,(37±1)℃振蕩100min(150r/min),得胃消化環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)樣品(樣品1).靜置,離心后取上清液0.5mL,測(cè)定汞溶出量.腸吸收環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn):將胃消化環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)所得樣品(樣品1)用1mol/L碳酸氫鈉滴定至中性,所需碳酸氫鈉體積為1.28mL.將1.28mL碳酸氫鈉水溶液加入透析袋中,透析袋置于胃消化模擬實(shí)驗(yàn)所得樣品(樣品1)中,(37±1)℃振蕩45min(150r/min),pH約為5.0,向透析袋中加入胰液-膽鹽(豬膽鹽)混合溶液2.0mL,(37±1)℃振蕩100min,收集透析液,得腸吸收環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)樣品(樣品2),測(cè)定汞透析量.朱砂中總汞含量的測(cè)定:精密稱取朱砂0.03g,加入1.0mL濃硫酸、0.15g硝酸鉀,100℃體外消化3h.測(cè)定總汞含量.1.2.4砂出率及生物可接率計(jì)算測(cè)定汞溶出量、汞透析量和總汞含量,每一樣品平行測(cè)定2次,取平均值.朱砂中汞的溶出率及生物可接受率公式如下:a=B/A×100%?b=C/A×100%a=B/A×100%?b=C/A×100%公式中a、b分別表示朱砂中汞的溶出率及生物可接受率,A、B、C分別表示朱砂中總汞量、胃模擬階段汞溶出量、汞在腸模擬階段透析量.1.3朱沙中的汞吸收動(dòng)力學(xué)1.3.1砂混懸液的配制Wistar大鼠(180～250g)24只,雌雄各半(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).按體重隨機(jī)分成三組(每組8只,雌雄各半).灌胃給予朱砂混懸液50mg/kg(以0.5%羧甲基纖維素鈉配制成7.5mg/kg的混懸液).給藥前禁食12h,不禁水.1.3.2不同給藥時(shí)間點(diǎn)眼后果靜脈取血大鼠于給藥前和給藥后15、30、60、90、120、150min、4h、6h、8h、12h、24h眼后緣靜脈取血.第一組大鼠給藥后15、90、150min、4h、12h取血;第二組大鼠給藥后30、120min、6h、24h取血;第三組大鼠給藥后60、150min、8h取血(每次取血0.2mL).血液樣品以肝素鈉抗凝.1.3.3砂中汞的藥動(dòng)學(xué)精密量取血液150μL,加入1.0mL硝酸放置過(guò)夜,加入1.0mL去離子水,混勻,高速離心5min(13000r/min),取上清液1.0mL加入0.4mL汞標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05mg/L),測(cè)定汞含量.樣品中汞含量等于測(cè)得量與標(biāo)準(zhǔn)加入量之差.計(jì)算每只大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的血汞濃度,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.繪制朱砂中汞的血藥濃度-時(shí)間曲線,計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù).1.4朱沙中鉻的排出研究1.4.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組Wistar大鼠(180～250g)8只,雌雄各半(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心).灌胃給予朱砂50mg/kg.收集每只大鼠0～12h、12～24h、24～48h、48～72h、72～96h的糞樣.1.4.2糞樣中汞含量測(cè)定精密稱取糞樣0.1g,加入1.0mL硝酸70℃體外消化1h,冷至室溫,加入1.0mL去離子水,混勻,高速離心5min(13000r/min),取上清液測(cè)定汞含量.測(cè)定每只大鼠不同時(shí)間段糞樣中的汞含量,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.2結(jié)果2.1儀器的檢測(cè)限和檢測(cè)限汞在1～16μg/L濃度的范圍內(nèi)吸光度與濃度線性關(guān)系良好,回歸方程為y=8.791x+7.695(r=0.9973).儀器的檢測(cè)限為0.5μg/L.朱砂中汞在胃模擬消化環(huán)境中的溶出量為94.6±8.7μg/g、腸模擬吸收環(huán)境中的透析量為27.1±1.7μg/g、總汞含量為816±19mg/g.經(jīng)計(jì)算朱砂在模擬胃消化環(huán)境中的溶出率為0.011%;在模擬腸吸收環(huán)境中的可接受率為0.0033%.2.2達(dá)峰時(shí)間及血藥濃度血藥濃度-時(shí)間曲線:灌胃給予臨床劑量的朱砂后,血液中汞濃度隨時(shí)間的變化曲線見(jiàn)圖1.藥動(dòng)學(xué)參數(shù)大鼠灌胃給予朱砂后汞的達(dá)峰時(shí)間(tmax)為(1.3±0.4)h,最高血藥濃度(ρmax)為(6.3±1.3)μg/L,消除半衰期(t1/2)為(4.2±0.5)h,血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)為(54.7±8.7)μg·h·L-1.2.3間段糞便中汞的排泄量糞樣排泄量:大鼠灌胃給予朱砂后不同時(shí)間段糞便中汞的排泄量見(jiàn)圖2.朱砂中汞在給藥后12h排泄量最大,24、48、72、96h的排泄量逐漸減少.3討論3.1體外消化透析法生物利用性是存在于一定基質(zhì)中的目標(biāo)物經(jīng)口腔攝入后能夠到達(dá)體內(nèi)循環(huán)的部分.生物可接受性是指經(jīng)口腔攝入后,從基體釋放到人體胃腸消化道的部分.生物可接受性是生物利用性的最大值,目前已經(jīng)成為生物利用性的替代測(cè)量方法.體外消化透析法是通過(guò)模擬人體內(nèi)消化環(huán)境,對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被人體吸收利用部分進(jìn)行評(píng)估的方法.近年來(lái),體外消化透析法已經(jīng)廣泛用于鉛、鎘、砷等金屬的生物可接受性研究.作者參照文獻(xiàn)方法采用體外消化透析法測(cè)定朱砂中汞的生物可接受性,發(fā)現(xiàn):朱砂在模擬胃消化環(huán)境中溶出的汞量遠(yuǎn)低于總汞含量,說(shuō)明朱砂中大部分汞都是以難溶的形式存在的;朱砂在模擬胃消化環(huán)境中的溶出量遠(yuǎn)大于其按溶度積(Ksp=1.6×10-52)計(jì)算的理論值,表明胃蛋白酶和酸性環(huán)境有助于朱砂中汞的溶出;經(jīng)小腸模擬消化后,汞的透析量更低,大大低于胃階段溶出率,這可能是由于透析過(guò)程只允許分子量小的物質(zhì)通過(guò),模擬消化過(guò)程中汞與蛋白酶或者胰液-膽鹽結(jié)合形成復(fù)合物后就很難通過(guò)透析膜.3.2砂漿蛋白的檢測(cè)血液中95%左右的巰基都存在于紅細(xì)胞中,由于Hg2+對(duì)巰基有高度的親和力,所以Hg2+可以迅速結(jié)合紅細(xì)胞,同時(shí)Hg2+又可與血漿蛋白(富含巰基的蛋白)結(jié)合,并與紅細(xì)胞中的Hg2+形成動(dòng)態(tài)平衡.所以本實(shí)驗(yàn)選擇全血研究汞在血液中的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律.血液中汞濃度較低,因此實(shí)驗(yàn)中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定血汞濃度.