多重腦震蕩后大鼠中縫核團(tuán)內(nèi)5-羥色胺的表達(dá)

多重腦震蕩后大鼠中縫核團(tuán)內(nèi)5-羥色胺的表達(dá)

運(yùn)動(dòng)腦振動(dòng)（src）是目前常見的運(yùn)動(dòng)損傷類型，尤其是在運(yùn)動(dòng)員接近和競(jìng)爭(zhēng)激烈的體育比賽項(xiàng)目中。雖然SRCC多數(shù)為輕型頭部損傷,但在一次腦震蕩(cerebralconcussion,CC)損傷后一部分傷者會(huì)出現(xiàn)頭痛、頭暈、注意力不集中、記憶不良等學(xué)習(xí)記憶等方面的障礙;如果運(yùn)動(dòng)員經(jīng)歷CC后還沒有完全恢復(fù),又遭受第二次CC后會(huì)出現(xiàn)更嚴(yán)重的神經(jīng)與學(xué)習(xí)記憶方面的障礙,甚至死亡。美國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界將其定義為二次沖擊綜合征(second-impactsyndrome,SIS)。由于目前關(guān)于CC的機(jī)理仍然不清,故臨床和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)也難以對(duì)SIS的機(jī)理進(jìn)行合理的解釋,對(duì)于SRCC和SIS后學(xué)習(xí)認(rèn)知行為相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)病理學(xué)變化研究也未見報(bào)道。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì),它對(duì)認(rèn)知功能、交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮、人體運(yùn)動(dòng)功能、疼痛和食欲等方面均起著重要的調(diào)節(jié)作用。國(guó)內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)研究及臨床證據(jù)表明:5-HT能神經(jīng)系統(tǒng)在腦損傷后發(fā)生了紊亂,主要表現(xiàn)為腦損傷后腦內(nèi)不同腦區(qū)5-HT合成和/或釋放增多,或5-HT代謝增強(qiáng)等。但這些變化僅僅來(lái)自于一次腦損傷的研究結(jié)果,它是否適用于SRCC和SIS還有待于進(jìn)一步研究。所以,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制多重腦震蕩(MCC)大鼠模型,應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)研究MCC后腦干中縫核團(tuán)內(nèi)5-HT免疫陽(yáng)性產(chǎn)物及合成5-HT的限速酶-色氨酸羥化酶(TPH)的表達(dá)變化,旨在為進(jìn)一步研究5-HT是否對(duì)MCC和SIS后的認(rèn)知障礙產(chǎn)生影響提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。材料和方法1.動(dòng)物供應(yīng)中心健康雄性SD大鼠56只,體重295±15g,購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物供應(yīng)中心。隨機(jī)分為7組:對(duì)照組,多重腦震蕩傷后1、2、4、8、16、24d組(每組n=8)。2.模型的建立與發(fā)展采用于建云等研制的金屬單擺打擊裝置給SD大鼠額頂部連續(xù)三次鈍性打擊(1次/d,連續(xù)3d打擊),復(fù)制出具有三次一過(guò)性腦功能障礙的MCC大鼠模型。3.抗生物素活性各組動(dòng)物定時(shí)用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)灌注固定取腦,連續(xù)冰凍切片,厚15μm。用抗5-HT、抗TPH抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)SP法染色,具體步驟如下:用檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH6.0)進(jìn)行抗原熱修復(fù),一抗為兔抗5-HT多克隆抗體(1∶2000,購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)組胚教研室)或綿羊抗TPH多克隆抗體(1∶1200,Chemicon公司),4℃孵育24h;生物素標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG,1∶150,邁新公司,室溫孵育15min)或(兔抗綿羊IgG,1∶300,KirkegaardandPerryLabs,室溫孵育1h);鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液(SP,1∶150,邁新公司),室溫孵育10min;DAB顯色,室溫孵育10min?？瞻讓?duì)照用0.01mol/L的PBS代替一抗;置換實(shí)驗(yàn)用正常羊血清或小牛血清代替一抗,其余步驟不變。4.量腦干中縫核團(tuán)內(nèi)5-ht和tph陽(yáng)性反應(yīng)物的平均粒度值應(yīng)用HPIAS-1000高清晰圖像文分析系統(tǒng)分別測(cè)量腦干中縫核團(tuán)內(nèi)5-HT能神經(jīng)元胞漿內(nèi)5-HT和TPH陽(yáng)性反應(yīng)物的平均灰度值(注:灰度值與所測(cè)物質(zhì)的濃度成反比,即灰度值越大,表示所測(cè)物質(zhì)的濃度越小)。5.單因素方差分析及q檢驗(yàn)應(yīng)用SPSS11.0軟件包對(duì)圖像分析測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗(yàn),數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(xˉ±Sxˉ)(xˉ±Sxˉ)表示,凡P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.各組tph免疫陽(yáng)性反應(yīng)比較TPH免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)主要定位于胞漿內(nèi),呈棕黃色,胞核不著色。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)未見著色,說(shuō)明此免疫組化實(shí)驗(yàn)具有特異性。MCC后1d組,中縫背核(dorsalraphenucleus,DR)內(nèi)TPH免疫陽(yáng)性反應(yīng)的產(chǎn)物有所升高,2d組達(dá)到高峰,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正中中縫核(medianraphenucleus,MnR)內(nèi)TPH免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在傷后1d時(shí)明顯升高(P<0.01);2d組陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)(P<0.01),4、8d組陽(yáng)性反應(yīng)有所減弱,但仍明顯高于對(duì)照組(P<0.05);24d組基本恢復(fù)正常。中縫大核(raphemagnusnucleus,RMg)內(nèi)TPH免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在傷后1、2、4、8d升高,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中以1d組陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)(P<0.01),16、24d組基本恢復(fù)。中縫蒼白核(raphepallidusnucleus,RPa)內(nèi)TPH免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物在傷后1、2、4d升高,與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中以4d組陽(yáng)性反應(yīng)最強(qiáng)(P<0.01),24d組基本恢復(fù)(表1,Figs.1A-1F)。2.皮膚免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)5-HT免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)主要定位于胞漿內(nèi),呈棕黃色,胞核不著色。陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)未見著色,說(shuō)明此免疫組化實(shí)驗(yàn)具有特異性。與對(duì)照組比較,中縫背核內(nèi)5-HT免疫陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的表達(dá)在傷后1d時(shí)明顯升高(P<0.05),2d達(dá)到高峰(P<0.01),4、8d組有所減輕,但仍均高于對(duì)照組(P<0.05),16、24d組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正中中縫核內(nèi)5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物在傷后2、4d時(shí)高于對(duì)照組(P<0.05),其中2d組達(dá)到高峰,16、24d組基本恢復(fù)正常。中縫大核和中縫蒼白核內(nèi)5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)也在傷后出現(xiàn)升高,但各損傷組與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2,Figs.1G-1L)。中縫小體中5-ht的表達(dá)國(guó)內(nèi)外許多研究表明:腦損傷后不同時(shí)間內(nèi)腦組織內(nèi)5-HT含量升高;血漿、腦脊液中5-HT的濃度明顯升高。但是,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅針對(duì)開放性腦損傷。于是,有學(xué)者對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦震蕩腦內(nèi)5-HT遞質(zhì)的變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)在腦震蕩后早期,腦組織內(nèi)5-HT含量升高。本實(shí)驗(yàn)所顯示的MCC后早期大鼠腦干中縫核團(tuán)內(nèi)TPH和5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物增強(qiáng)的結(jié)果與以往的報(bào)道相似,進(jìn)一步證實(shí)了腦損傷后早期腦干內(nèi)5-HT能神經(jīng)元的活性確實(shí)有所增強(qiáng)。關(guān)于腦損傷后早期腦干中縫核團(tuán)內(nèi)TPH和5-HT增高的原因,可能是腦損傷后神經(jīng)元過(guò)度興奮的一種反應(yīng)。有資料表明,腦損傷時(shí)作用于神經(jīng)系統(tǒng)的瞬間機(jī)械暴力達(dá)到一定程度,導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元過(guò)度興奮,Ca2+通道開放,大量細(xì)胞外的Ca2+迅速進(jìn)入細(xì)胞;同時(shí)由于損傷導(dǎo)致局部組織缺血缺氧,能量代謝障礙,Na+-K+-ATP酶活性下降,ATP酶耗竭,鈣泵活性受到抑制,使細(xì)胞內(nèi)Ca2+的轉(zhuǎn)出減少。這些因素共同作用造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+處于超載狀態(tài)。一方面,大量的Ca2+可促使突觸前成分釋放5-HT增多,突觸前終末內(nèi)5-HT的含量減少,從而通過(guò)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制使胞體中的5-HT的合成進(jìn)一步增加;另一方面,神經(jīng)元內(nèi)TPH的活性也可被Ca2+激活而提高,加速了5-HT的合成,造成5-HT大量堆積。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,中縫背核(DR,B7群)和正中中縫核(MnR,B6+B8群)神經(jīng)元內(nèi)TPH和5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)均在傷后2d達(dá)到高峰,說(shuō)明MCC后DR和MnR內(nèi)TPH蛋白表達(dá)增強(qiáng),活性增高,進(jìn)而使5-HT合成增多。中縫大核(RMg,B3群)和中縫蒼白核(RPa,B1群)神經(jīng)元內(nèi)TPH免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)也分別在傷后1d和4d最強(qiáng),而RMg和RPa神經(jīng)元內(nèi)5-HT免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的表達(dá)在傷后變化不明顯。我們推測(cè)這種陽(yáng)性反應(yīng)表達(dá)的非同步性可能是由于合成5-HT的前體氨基酸-色氨酸在RMg和RPa內(nèi)含量不足,或者是在RMg和RPa中表達(dá)的TPH不能完全發(fā)揮其生物學(xué)活性,而使RMg和RPa內(nèi)5-HT表達(dá)的增高不明顯所致。TPH作為合成5-HT的限速酶,在反應(yīng)過(guò)程中需要有輔酶四氫生物喋呤(BH4)的參與,如果BH4不足或缺失,TPH將不能完全催化底物生成足夠的產(chǎn)物。RMg和RPa中TPH的表達(dá)高于5-HT的表達(dá),這種不一致性,究竟是由于RMg和RPa內(nèi)色氨酸攝取不足還是BH4的缺乏所致,其機(jī)理還有待于進(jìn)一步深入研究。近年來(lái),國(guó)外學(xué)者還在人和大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)有與5-HT釋放有關(guān)的蛋白質(zhì)-5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT),它在調(diào)節(jié)5-HT能神經(jīng)元活動(dòng)方面也有重要作用。5-HTTmRNA只分布在中縫5-HT神經(jīng)元胞體內(nèi),在胞體中合成5-HTT后經(jīng)軸漿運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)末梢,在Na+介導(dǎo)下將釋放到突觸間隙的5-HT遞質(zhì)重吸收到突觸前膜內(nèi)存儲(chǔ)。因此,5-HTT被認(rèn)為是一種不需要Ca2+介導(dǎo)的調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的物質(zhì),它在神經(jīng)末梢對(duì)5-HT的釋放-再吸收循環(huán)發(fā)揮重要作用。目前,對(duì)腦內(nèi)5-HTT