高效液相色譜法測(cè)定左氧氟沙星血藥濃度

高效液相色譜法測(cè)定左氧氟沙星血藥濃度

左氧氟沙星（lvll）是氧氟沙星的光學(xué)活性異構(gòu)體，其抗菌活性約為氧氟沙星的兩倍。臨床用于治療敏感菌引起的中、重度呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和皮膚軟組織感染等。為開展LVFX臨床藥物動(dòng)力學(xué)及LVFX與其他藥物之間的藥物動(dòng)力學(xué)相互作用研究,我們建立了測(cè)定LVFX血藥濃度的高效液相色譜法。1材料和方法1.1u3000交流波長(zhǎng)紫外檢測(cè)儀器Waters高效液相色譜儀,包括M510型泵,486型可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器,U6K進(jìn)樣器,746型數(shù)據(jù)處理機(jī)(美國(guó)Waters公司)。色譜柱為YWG-G18柱(大連依利特公司)。1.2苯精、鹽酸左氧氟沙星膠囊鹽酸左氧氟沙星對(duì)照品(丹東錦江藥廠,批號(hào)000216),替硝唑精制品(湖北廣濟(jì)藥業(yè)有限公司,批號(hào)970609),鹽酸左氧氟沙星膠囊(本院制劑室,批號(hào)990713)。甲醇、乙腈為色譜純,水為亞沸蒸餾水,溴化四丁基銨、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇等試劑為分析純。1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取左氧氟沙星對(duì)照品、替硝唑精制品適量,分別用甲醇和無(wú)水乙醇溶解后定容,配成濃度為1mg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。左氧氟沙星置冰箱4℃,替硝唑置室溫避光處保存。臨用前用甲醇稀釋至所需濃度。1.4醇-乙腈-1.1mol-1磷酸二氫鉀-1.5和磷酸化四丁基銨5.5%的優(yōu)化色譜柱:YWG-C18柱,10μm,200mm×5mm;流動(dòng)相:甲醇-乙腈-0.01mol·L-1磷酸二氫鉀-0.5mol·L-1溴化四丁基銨(10∶10∶80∶4),磷酸調(diào)pH3.5;流速:1.0ml/min,柱溫:室溫,紫外檢測(cè)波長(zhǎng):294nm,進(jìn)樣量:20μl。1.5水相溶解-水相溶解gc/l取血清0.5ml,置10ml具塞試管中,加內(nèi)標(biāo)液(0.1mg·ml-1替硝唑液)5μl,加乙酸乙酯4.5ml,渦旋5min,3000r/min離心10min,取上清液4.0ml,50℃水浴下氮?dú)獯蹈?殘?jiān)?00μl流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣。2結(jié)果2.1內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定在上述色譜條件下,LVFX與內(nèi)標(biāo)得到較好的分離,保留時(shí)間分別為5.8min和9.5min,血清中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定,理論塔板數(shù)按LVFX峰計(jì)算為1160。色譜圖見圖1。2.2血樣、回血處理取空白血清,加入不同量的LVFX對(duì)照品溶液,使?jié)舛确謩e為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0mg·L-1,按照“1.5血樣處理”項(xiàng)下操作,每個(gè)濃度平行做7份。經(jīng)色譜分離,計(jì)算LVFX峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(As/Ai),以As/Ai為橫坐標(biāo),LVFX濃度C(mg·L-1)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸,得血清中LVFX標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為:C=0.5977As/Ai-0.0053,r=0.99996當(dāng)S/N≥3時(shí),最小檢測(cè)濃度為0.025mg·L-1。2.3加樣回收率測(cè)定制備LVFX濃度分別為0.2、0.5和2.0mg·L-1的血清樣品各5份,按照“1.5血樣處理”項(xiàng)下操作,進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。3種濃度的平均回收率為99.33%,RSD為4.68%,見表1。2.4日內(nèi)rsd測(cè)定在空白血清中分別加入不同量的LVFX對(duì)照品溶液,制備成LVFX血清濃度分別為0.2、0.5、2.0mg·L-1的樣品,按照“1.5血樣處理”項(xiàng)下操作,1d內(nèi)重復(fù)測(cè)定5次,測(cè)得日內(nèi)RSD分別為4.21%,1.77%和4.05%。另取上述不同濃度的血清樣品,同法處理,重復(fù)測(cè)定5d,測(cè)得日間RSD分別為4.86%,5.47%和2.87%。2.5血藥濃度檢測(cè)健康雜種犬3只,♂♀兼有,體重13～16kg,poLVFX膠囊100mg,于給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0,12.0、24.0h分別取靜脈血1ml,分離血清,按照“1.5血樣處理”項(xiàng)下操作,測(cè)定血藥濃度。用3P87實(shí)用藥代動(dòng)力學(xué)程序?qū)】等畃oLVFX后的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合,模型判斷符合一級(jí)吸收二室模型,藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。3沖液與有機(jī)溶劑的比例和ph值的影響文獻(xiàn)報(bào)道用高效液相色譜法測(cè)定LVFX血藥濃度時(shí),流動(dòng)相多采用磷酸-乙腈或甲醇-磷酸鹽緩沖液,并分別加入三乙銨或溴化四丁基銨改性。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液-溴化四丁基銨溶劑系統(tǒng)中加入乙腈可使峰形及分離度得到改善。緩沖液與有機(jī)溶劑的比例和pH值對(duì)保留時(shí)間和分離度有影響,隨著緩沖液比例增加或pH值增高,保留時(shí)間延長(zhǎng)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)我們選擇緩沖液比例為80%,pH3.5,使LVFX峰與內(nèi)標(biāo)峰的分離度及保留時(shí)間均符合要求。在選擇血清樣品處理方法時(shí),曾試用高氯酸、三氯乙酸、乙腈等沉淀蛋白,離心后取上清液直接進(jìn)樣,用二氯甲烷-異丙醇混合溶劑、乙醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑萃取,氮?dú)獯蹈?流動(dòng)相重組后進(jìn)樣等方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,用乙酸乙酯萃取的方法干擾成分少且樣品及內(nèi)標(biāo)萃取效率高。本文所建立的方