大鼠下肢急性缺血后血流、血壓及肌肉組織的動(dòng)態(tài)變化

大鼠下肢急性缺血后血流、血壓及肌肉組織的動(dòng)態(tài)變化

據(jù)統(tǒng)計(jì)，在美國，每年15萬人無法接受干預(yù)和手術(shù)，因?yàn)橄轮珖?yán)重缺血。但隨著再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展,Isner等提出治療性血管新生(therapeuticangiogenesisTA)的概念,即將外源性血管新生誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)入缺血組織中以促進(jìn)血管新生和側(cè)支循環(huán)的建立。在血管外科,近幾年來骨髓來源干細(xì)胞治療慢性下肢缺血已成為一種治療缺血性疾病新的嘗試。基于此,肢體缺血模型的建立對于TA的效應(yīng)研究尤為顯得重要。本實(shí)驗(yàn)對目前常用的下肢缺血模型的血流和血壓動(dòng)態(tài)演變及肌肉組織改變進(jìn)行系統(tǒng)觀察,以探索動(dòng)物模型的最佳條件,為后續(xù)的干預(yù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1激光多普勒血流檢測儀器1SPF級雄性Lewis大鼠10只,平均體質(zhì)量約300～400g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。激光多普勒血流探測儀,激光多普勒血流成像儀(購自瑞典百靈威醫(yī)療儀器中國公司);顯微基礎(chǔ)手術(shù)器械,血管造影機(jī)為美國GE醫(yī)療器械公司產(chǎn)品。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1規(guī)備皮消毒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)10%水合氯醛溶液4μL/kg腹腔注射麻醉,仰臥固定,左下肢常規(guī)備皮消毒?？v行切開左下肢正中的皮膚,于腹股溝下分離出股動(dòng)脈,范圍從腹股溝韌帶直至膝關(guān)節(jié)。在腹股溝韌帶下切斷股動(dòng)脈,雙重結(jié)扎近端,隨后向遠(yuǎn)端銳性剝離至膝關(guān)節(jié),結(jié)扎股動(dòng)脈于股部的所有分支,并結(jié)扎腘動(dòng)脈及腓動(dòng)脈。術(shù)畢,縫合切口。1.2.2手術(shù)后觀察指標(biāo)和方法1.2.2.患下肢肢體評估術(shù)后2,7,14,42,49d對每只動(dòng)物情況的評估:包括患肢活動(dòng)狀況、肢體顏色、溫度、有無潰瘍、有無足趾壞疽及脫落等。0=正常,1+=患肢蒼白,2+=血壓下降,3+=壞死或者間歇性的跛行。1.2.2.根據(jù)《血食數(shù)據(jù)分析》h術(shù)后2,7,14,42,49d,每次取大鼠2只,常規(guī)麻醉后,在室溫26℃相對恒定下,分別于動(dòng)物的足底放置激光探頭,連續(xù)測量基礎(chǔ)5min;記錄雙側(cè)血流基礎(chǔ)值(PU值),計(jì)算患側(cè)/健側(cè)比率。隨后于雙下肢股根部外加寬1.2cm袖帶的同時(shí),足底放置激光多普勒探頭。袖帶加壓至200mmHg(1mmHg=0.133kPa)后,逐漸減壓。在持續(xù)減壓的同時(shí)記錄血流變化情況,以血流開始恢復(fù)的起點(diǎn)所對應(yīng)的血壓值為該側(cè)肢體收縮壓;連續(xù)測量3次取平均值為患側(cè)和健側(cè)血壓值。同時(shí)對手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)血壓及血流的比值進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。1.2.2.下肢血管造影于術(shù)后2,7,14,42,49d時(shí)間點(diǎn)分別取2只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,常規(guī)麻醉動(dòng)物后開腹,切開后腹膜行腹主動(dòng)脈留置套管針,充分注射肝素生理鹽水后,通過腹腔注射水合氯醛溶液5～7mL處死動(dòng)物并固定體位。以2.5mL/s的速率注射造影劑(泛影葡胺)共5mL進(jìn)行下肢血管造影,對雙下肢連續(xù)拍照,用數(shù)字減影的方法處理造影結(jié)果。結(jié)果分析:以腹主動(dòng)脈分叉處顯影后1.5s時(shí)攝片為依據(jù),計(jì)算通過右股骨中點(diǎn)垂直線的血管數(shù)目,表示側(cè)支血管開放的程度。(由兩位獨(dú)立的觀察者對垂直通過股骨中點(diǎn)的側(cè)枝血管進(jìn)行計(jì)數(shù))。術(shù)畢,取大鼠雙下肢股四頭肌,腓腸肌,甲醛固定后行用石蠟包埋連續(xù)切片,每張切片用蘇木精及伊紅染色。1.3組間比較方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。組間比較采用方差分析或兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn),各組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)顯著性取α=0.05,P<0.05為差異有顯著性。2結(jié)果2.1手術(shù)側(cè)肢體腐爛所有動(dòng)物成活?？捎^察到部分動(dòng)物出現(xiàn)后肢缺血表現(xiàn),如后肢跛行(2例),發(fā)紺2例,蒼白3例,肌肉萎縮1例。但是未發(fā)現(xiàn)手術(shù)側(cè)肢體壞死和潰瘍。術(shù)后2周內(nèi)均分為2+,在49d均分為1+。2.2術(shù)后恢復(fù)至對側(cè)肢體的30d患肢血流術(shù)后7d下降,術(shù)后28d下降至最低點(diǎn)(正常側(cè)肢體的40%);術(shù)后49d恢復(fù)至對側(cè)正常肢體的90%以上(圖1A)。術(shù)后2d血壓明顯下降,14d下降到最低點(diǎn),后逐漸恢復(fù);至術(shù)后49d基本恢復(fù)正常(圖1B)。2.3股部血管數(shù)量分布術(shù)后2d缺血側(cè)遠(yuǎn)端無血管顯影,患肢在術(shù)后7d,股部即出現(xiàn)側(cè)支循環(huán)開放,表現(xiàn)為患側(cè)小血管數(shù)量多于健側(cè);在術(shù)后28d達(dá)高峰,患側(cè)血管數(shù)量顯著高于健側(cè);術(shù)后49d兩側(cè)側(cè)支血管數(shù)量基本相同(圖2-3)。2.4因血中實(shí)物測定sda大鼠后肢肌肉組織學(xué)HE染色可見:大部分肌肉組織未出現(xiàn)明顯的壞死。少數(shù)(4例)表現(xiàn)為:術(shù)后早期(2d)缺血肌肉部分出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死,在胞漿中現(xiàn)均勻一致(圖4A);至中期(14～28d)出現(xiàn)肌肉結(jié)構(gòu)破壞,期間大量炎性細(xì)胞浸潤(圖4B),后期(42～49d)后肢的肌肉出現(xiàn)萎縮,表現(xiàn)為肌間隙明顯增加(圖4C)。3術(shù)后大鼠肢體活檢情況目前國內(nèi)外普遍采用急性后肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ?制備主要是通過結(jié)扎股動(dòng)脈、髂外動(dòng)脈、或剝脫股動(dòng)脈以造成后肢的急性缺血,一般認(rèn)為,在急性缺血的后期是慢性缺血過程。在血管新生的機(jī)制中,認(rèn)為急性缺血后,局部產(chǎn)生的剪切力、炎性反應(yīng)、內(nèi)皮主細(xì)胞的局部浸入;以上三大機(jī)制都在短時(shí)間內(nèi)參與血管新生和生成。急性缺血是肢體缺血模型的主流,應(yīng)用最為廣泛。其制作方法大體上以結(jié)扎并切除后肢的供血?jiǎng)用}主干或其分支為主。但是,在大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中,如果結(jié)扎并切斷某一支供血?jiǎng)用}的近端,通常引起遠(yuǎn)端肢體缺血壞死的情況并不明顯,因而新的動(dòng)物模型也不斷出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用切斷后肢股動(dòng)脈的方法制備急性缺血模型,術(shù)后動(dòng)物較少出現(xiàn)急性下肢壞死,分析其原因可能與大鼠后肢供血?jiǎng)用}分支之間以及盆部與下肢動(dòng)脈分支之間存在豐富的吻合有關(guān)。故即使結(jié)扎甚至剝離下肢股動(dòng)脈,大鼠仍不會(huì)表現(xiàn)為嚴(yán)重的缺血,但血流和血壓的測定卻可發(fā)生缺血明顯的變化。本實(shí)驗(yàn)對動(dòng)物模型進(jìn)行為期49d的觀察,可以看到患肢的血流在術(shù)后7d即出現(xiàn)下降,術(shù)后28d下降到最低點(diǎn),術(shù)后42d恢復(fù)到對側(cè)(正常肢體)的90%以上。術(shù)后28d為最低,術(shù)后42d基本恢復(fù)正常。術(shù)后42d側(cè)支循環(huán)開放達(dá)到高峰。總的來說缺血的時(shí)間僅能維持4～6周。患肢血壓在術(shù)后2d明顯下降,14d血壓下降至最低點(diǎn),后逐漸恢復(fù),分析此結(jié)果的原因:一方面可能與嚙齒類動(dòng)物自身的生理特點(diǎn)有關(guān);另一方面,在后肢急性缺血狀態(tài)下,急劇增加的血管剪切力和局部點(diǎn)狀壞死后炎性細(xì)胞的浸潤(許多炎性細(xì)胞是多種血管生長因子的重要來源),造成了側(cè)支血管在短時(shí)