神經(jīng)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡抑制基因bcl-2表達(dá)的影響

神經(jīng)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡抑制基因bcl-2表達(dá)的影響

脊柱損傷（rc）是一種嚴(yán)重的損傷，包括核電站損傷和后續(xù)損傷。原發(fā)損傷為不可逆性改變,而繼發(fā)性損傷具有可逆性,且在原發(fā)性損傷后較長一段時間內(nèi)顯現(xiàn)。近年研究證實,神經(jīng)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的神經(jīng)元大量丟失是脊髓繼發(fā)性損傷的重要病理機(jī)制,有效抑制這部分神經(jīng)細(xì)胞的凋亡成為SCI治療的一個重要途徑。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)能有效地抑制細(xì)胞凋亡,是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。目前,神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)移植成為治療脊髓損傷的新的研究熱點,但對移植后脊髓神經(jīng)細(xì)胞的凋亡研究報道較少,本研究旨在動態(tài)觀察胎鼠NSCs移植對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡抑制基因Bcl-2表達(dá)的影響,從而為NSCs移植治療SCI提供理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試劑和試劑成年健康雄性清潔級SD大鼠,體質(zhì)量250±20g(徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心);5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)抗體(均Sigma公司),DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基(Hyclone),B27復(fù)合物(Gibco),bFGF(Invitrogen),EGF(Invitrogen),胎牛血清(杭州四季青),多聚賴氨酸(Sigma),巢蛋白(nestin)抗體(Sigma),NSE抗體(Sigma),DAB液體(Boster),Bcl-2單克隆抗體(SantaCruz公司),SABC免疫組化試劑盒(Zymed),TUNEL試劑盒(RocheDiagnosticsGmbHMannheim),其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。自行研制的電控脊髓損傷自動打擊裝置。1.2胚胎神經(jīng)干的分離、培養(yǎng)和鑒定參見作者以往研究進(jìn)行。1.3brdu對brvi的調(diào)整移植前2d取處于對數(shù)生長期的NSCs離心后加入無血清培養(yǎng)液,輕柔吹打混勻成單細(xì)胞懸液,計數(shù)后調(diào)整種植密度為1106/ml,按20μmol/L的終濃度加入BrdU,放入培養(yǎng)箱中孵育48h,離心棄上清,用少量無血清培養(yǎng)液重懸成單細(xì)胞,計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/μl。將移植后剩余細(xì)胞懸液進(jìn)行臺盼藍(lán)(typanblue)染色,NSCs活性仍在90%～95%。1.4腰椎椎形骨折圖5SD大鼠40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為BrdU+NSCs組、NSC組、SCI組和假手術(shù)組(Normal組),每組10只。Normal組僅做椎板切開術(shù)。2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉(30mg/kg),以T10棘突為中心作背部正中切口,長約2cm,依次切開皮膚、皮下組織,剝離椎旁肌肉,輕輕咬除T10棘突和椎板,打開椎管至椎弓根部,暴露待損傷脊髓約5mm,注意保護(hù)硬脊膜完整。脊髓損傷(SCI)模型制備:用兩把文氏鉗分別鉗住T9和T11棘突并向兩側(cè)牽拉以固定脊髓。以T10相對區(qū)域為損傷區(qū),脊髓后正中血管為中心,用電磁程控鐵棒下落打擊裝置(10g質(zhì)量以5cm高度自由落下)致傷脊髓,打擊強(qiáng)度為50(5.0cm×10g)勢能克厘米(gram-cmforce,gcf)。撞擊成功標(biāo)準(zhǔn)為:撞擊的脊髓組織水腫、出血,大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動,雙后肢軀體回縮樣撲動,雙后肢呈現(xiàn)弛緩性癱瘓。然后逐層關(guān)閉手術(shù)切口,記錄手術(shù)時間,大鼠死亡及時復(fù)制模型補(bǔ)充。1.5小鼠硬脊膜無定形性nscs的開皮爾克氏體5.2.4造模成功后即刻參考Miura等的方法行NSCs移植:麻醉后固定于立體定位儀上,原切口進(jìn)入,在平T13棘突處硬脊膜背側(cè)正中血管旁1mm處輕輕挑開硬脊膜成一縱行小口,用漢密爾頓微量注射器,向頭側(cè)呈45°角進(jìn)針,深度1.5mm,將細(xì)胞濃度為2×105/μl的NSCs懸液5μl、生理鹽水5μl分別注入NSC組、SCI組,10min內(nèi)推入,保留5min后退出。1.6切片和細(xì)胞培養(yǎng)NSCs移植后1、3、7、14、28d取材,大鼠在深麻醉下,以0.4%多聚甲醛行心臟灌流固定,取損傷段脊髓,在30%蔗糖磷酸鹽緩沖液中沉底后,石蠟包埋固定,連續(xù)切片,片厚5μm,切片收集于裝有0.01mol/LPBS的細(xì)胞培養(yǎng)板的兩孔中,依次留片,每孔中留片15張。用SABC法行Bcl-2免疫組織化學(xué)染色,主要步驟簡述如下:(1)60℃恒溫烤箱中烤片1h。(2)二甲苯試劑依次脫蠟,梯度灑精依次浸泡,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,抗原修復(fù)。(3)滴加適當(dāng)稀釋的一抗Bcl-2后加入生物素化山羊抗小鼠IgG。(4)DAB顯色,梯度酒精浸泡,中性樹脂封片,晾干。陰性對照用PBS代替一抗。細(xì)胞胞漿中含有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。1.7tunel反應(yīng)液制備主要步驟簡述如下:(1)切片脫蠟至水,3%H2O2室溫10min。(2)0.01mol/LCB緩沖液(pH6.0)200ml中,750W微波修復(fù)1min,取出后迅速加入80ml雙蒸水。(3)加動物血清封阻,室溫30min;Tunel反應(yīng)液,避光37℃1h,0.01mol/LPBS洗5min×3次,避光。(4)熒光顯微鏡觀察并用數(shù)碼相機(jī)同時拍攝照片留用。(5)加PoD37℃,30min,0.01mol/LPBS洗5min×3次。(6)DAB顯色,流水沖洗10min,脫水、透明、封固。1.8大鼠斜板試驗分別于移植后1d、3d、7d、14d、28d采用斜板試驗(改良Rivlin法)對大鼠進(jìn)行功能評定,斜板表面墊以6mm厚的橡膠墊,板可繞下邊旋轉(zhuǎn),按大鼠身體軸線與斜板縱軸垂直的方向放置大鼠,從水平位置(0o)起逐漸增大斜板與水平面之間的角度,以大鼠能夠在板上停留5s而不跌落的最大角度作為評分標(biāo)準(zhǔn),雙后肢分別評分,重復(fù)3次取平均值。斜板試驗主要觀察大鼠后肢的靜態(tài)肌張力,正常大鼠斜板實驗評分平均值在75°～80°之間。觀察者為熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)但非本組的實驗人員。1.9細(xì)胞計數(shù)和光密度值采用LEICAQWin圖像處理與分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每張切片選取5個不重復(fù)脊髓損傷區(qū)域高倍視野圖像進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)和光密度值測定。計量資料以χˉˉ±sχˉ±s表示,采用SPSS14.5統(tǒng)計軟件行單因素方差分析(ANOVA),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1brd和14d移植細(xì)胞體外生長移植組的BrdU陽性細(xì)胞呈時間依賴性變化趨勢:BrdU陽性細(xì)胞在移植術(shù)后7d可檢測到,為棕黃色核標(biāo)記的小圓形細(xì)胞,沿移植穿刺針道呈串珠狀排列,BrdU陽性細(xì)胞平均每高倍鏡視野陽性細(xì)胞數(shù)為6.81.3;14d移植細(xì)胞在臨近損傷區(qū)逐漸增多,陽性細(xì)胞數(shù)為17.42.5(P<0.01),且向移植針道周圍遷移可達(dá)1.1cm;移植術(shù)后28d陽性細(xì)胞逐漸減少并消失,其余各組無陽性細(xì)胞(見圖1)。2.2小鼠骨髓損傷后凋亡細(xì)胞的變化TUNEL標(biāo)記免疫組化陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)于脫髓鞘區(qū)域,細(xì)胞核染成棕黃色的為凋亡陽性細(xì)胞。Normal組各時間點幾乎看不到陽性細(xì)胞。SCI組大鼠脊髓損傷后1d可見較多標(biāo)記凋亡細(xì)胞,3d達(dá)高峰,以后呈下降趨勢,28d時仍有較多凋亡標(biāo)記細(xì)胞。NSC組凋亡細(xì)胞高峰出現(xiàn)在傷后7d,但各時間點凋亡細(xì)胞數(shù)均較SCI組明顯減少(P<0.01)。免疫熒光染色結(jié)果同免疫組化染色結(jié)果相似。BrdU+NSC組與NSC組之間比較結(jié)果無明顯差異(P>0.05),排除了BrdU對實驗結(jié)果的影響(見表1、表2、圖2～圖4)。2.3sd-2免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目及光密度值在Normal組大鼠脊髓中,Bcl-2呈少量的胞漿表達(dá),棕黃色,染色強(qiáng)度較低,主要位于脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元、后角等,有時可見到神經(jīng)元突起著色。SCI組大鼠脊髓在損傷后1d,Bcl-2免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目、光密度值較Normal組增加,兩者相比有顯著性差異(P<0.01),到3d光密度值OD達(dá)到高峰,隨后逐漸下降;至28d為最低。NSC組大鼠在脊髓損傷后1d,脊髓前角、背角中的Bcl-2免疫陽性的神經(jīng)元為胞膜和胞漿著色,染色深時突起顯示明顯,Bcl-2的光密度值在損傷后的7d達(dá)到最高值,表達(dá)高峰較SCI組明顯延長,隨后開始下降,28d為其最低值,Bcl-2光密度值各時間點均比SCI組高(P<0.01)。BrdU+NSC組與NSC組之間比較結(jié)果無明顯差異(P>0.05)(見表3、圖5)。2.4brdu+nsc對小鼠血清內(nèi)火炬樹葉片生長和形貌的影響移植后7d、14d、28d,NSC組斜板試驗評分比SCI組明顯升高(P<0.01),但與Normal組相比仍有一定差距(P<0.001),BrdU+NSC組與NSC組之間比較結(jié)果無明顯差異(P>0.05)(見表4)。3brd移植后細(xì)胞在髓內(nèi)的凋亡脊髓損傷是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。目前,神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷是一種可行、有效的方法,其可能機(jī)制是:(1)神經(jīng)營養(yǎng)作用:神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,改善脊髓局部微環(huán)境,并啟動再生相關(guān)基因的順序表達(dá),使損傷的軸突開始再生。(2)支持、橋接作用:移植的神經(jīng)干細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì)填充脊髓損傷后遺留的缺損或空腔,為再生的軸突提供支持物,促進(jìn)受損的神經(jīng)元軸突再生和神經(jīng)環(huán)路重建。(3)替代作用:代替損傷節(jié)段缺失的運(yùn)動神經(jīng)元,發(fā)出軸突經(jīng)過外周神經(jīng)支配效應(yīng)肌肉,在宿主受體和干細(xì)胞分化的神經(jīng)元之間形成突觸中繼。(4)再髓鞘化作用:防止宿主神經(jīng)元軸突切斷后發(fā)生逆行性潰變、壞死,使殘存脫髓鞘的神經(jīng)纖維和新生的神經(jīng)纖維形成新的髓鞘。脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷,研究證實,繼發(fā)性脊髓損傷中出現(xiàn)的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡一定程度都是繼發(fā)細(xì)胞凋亡的結(jié)果;如何抑制細(xì)胞凋亡,是保護(hù)神經(jīng)元、修復(fù)脊髓損傷的一大難題;神經(jīng)干細(xì)胞移植到損傷脊髓后對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響是我們關(guān)注的重點。本實驗將分離培養(yǎng)及鑒定的胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞用BrdU標(biāo)記后移植入損傷脊髓,移植后14d在脊髓損傷區(qū)域觀察到BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞向移植針道周圍遷移可達(dá)1.1cm;采用原位末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸生物素缺口末端標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記凋亡細(xì)胞,免疫組化及免疫熒光顯色均顯示移植后各時間點凋亡細(xì)胞數(shù)均較單純脊髓損傷組明顯減少(P<0.01);上述結(jié)果表明,體外培養(yǎng)的胚胎大鼠NSCs可在脊髓損傷區(qū)域存活、遷移,并能減少脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。BrdU+NSC組與NSC組之間比較結(jié)果無明顯差異(P>0.05),排除了BrdU對實驗結(jié)果的影響。細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控的一個“瀑布式”激活過程,其主要通路分別為死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑(外在途徑)和線粒體凋亡途徑(內(nèi)在途徑)。在SCI中Bcl-2基因家族是決定細(xì)胞凋亡的重要因子之一,是迄今研究最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。Bcl-2是Gross于1985年從伴有14、18染色體易位的人濾泡性淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,主要位于線粒體外膜、核被膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,Bcl-2家族都具有Bcl-2同源體(BH),它有4個區(qū)域,分別是BH1、BH2、BH3和BH4。Bcl-24個區(qū)域都具有,其中抗凋亡所必須的是BH1,BH2和BH4,構(gòu)成一個疏水結(jié)構(gòu),可與促凋亡蛋白的BH3相結(jié)合形成復(fù)合體,從而抑制凋亡基因的活性。Bcl-2基因產(chǎn)物是細(xì)胞凋亡的一種強(qiáng)力抑制劑,其抑制細(xì)胞凋亡基因機(jī)制為:(1)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+的釋放;(2)阻止促凋亡基因信號傳遞或阻止誘導(dǎo)某些基因表達(dá);(3)抑制自由基。本實驗觀察到,脊髓損傷后3dBcl-2免疫陽性細(xì)胞表達(dá)達(dá)到高峰,隨后逐漸下降;將胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植入損傷脊髓后發(fā)現(xiàn),Bcl-2免疫陽性細(xì)胞光密度值在損傷后的7d達(dá)到最高值,表達(dá)高峰較SCI組明顯延長,隨后緩慢下降,統(tǒng)計學(xué)分析各時間點表達(dá)均比SCI組高(P<0.01),實驗結(jié)果一方面表明SCI后細(xì)胞凋亡隨時間推移呈現(xiàn)從出現(xiàn)到高峰后逐漸減少的規(guī)律,另一方面更重要的提示,胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植能明顯上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá),從而啟動Bcl-2抗凋亡的級聯(lián)反應(yīng),減少脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡,具體的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步深入研究。本實驗還觀察到,移植后7d、14d、28d,NSC組斜板試驗評分比SCI組明顯升高(P<0.01),BrdU+NSC組與NSC組之間比較結(jié)果無明顯差異(P>0.05),結(jié)果表明,NSCs移植損傷脊髓后可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用,從而促進(jìn)神經(jīng)