液相色譜法測定牛奶中替米考星、泰樂菌素和螺旋霉素的殘留量

液相色譜法測定牛奶中替米考星、泰樂菌素和螺旋霉素的殘留量

氨基硅酮、天竺葵素和螺旋霉菌屬于16位環(huán)內(nèi)酯類抗生素。該類藥物廣泛地用作獸藥或飼料添加劑,預(yù)防和治療牛、羊、豬、雞等動物的感染性疾病,替米考星和泰樂菌素被廣泛的加入到飼料用作生長促進(jìn)劑。這些藥物隨動物性食品進(jìn)入人體后不僅會產(chǎn)生直接的毒性,還會發(fā)生過敏反應(yīng)及產(chǎn)生耐藥細(xì)菌。為保護(hù)食品安全和人類生命健康,很多國家如加拿大、歐盟、美國、日本等國對該類藥物設(shè)置了較低的最高殘留限量,如歐盟對該類藥物最高殘留限量作了明確的規(guī)定,在肉制品中替米考星為50μg/kg,泰樂菌素為100μg/kg,螺旋霉素為200μg/kg。因此迫切需要研究一些高靈敏度、快速的方法對該類藥殘進(jìn)行檢測監(jiān)控。國外已有一些相關(guān)檢驗(yàn)方法,如使用液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)檢測紅霉素和螺旋霉素。國內(nèi)目前此類藥物的相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)缺乏,只有螺旋霉素和泰樂菌素有SN標(biāo)準(zhǔn),且都是使用微生物杯碟法,檢驗(yàn)周期長,靈敏度也不夠高。國內(nèi)對該類藥物檢測方法的報(bào)道較少。1實(shí)驗(yàn)部分1.1螺旋霉素和泰樂菌素螺旋霉素(Spiramycin)、泰樂菌素(Tylosin)、替米考星(Tilmicosin)均購自Dr.Ehrenstorfer。螺旋霉素(Spiramycin)和替米考星(Tilmicosin)純度均大于98.5%,泰樂菌素(Tylosin)純度大于95%。Na2HPO4、NaH2PO4、檸檬酸、三氟乙酸、正已烷均為分析純,甲醇和乙腈為色譜純。1.2萃取條件和萃取小柱安捷倫1100高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測器),離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速4500r/min),高速均質(zhì)器(最高轉(zhuǎn)速20000r/min),固相萃取裝置,固相萃取小柱:BondElutSCX苯磺酸陽離子交換柱(3mL,500mg)或相當(dāng)者,BondElutC18柱(3mL,500mg)或相當(dāng)者,氮吹儀,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,振蕩器。1.3osol/l流動相水相(以下簡稱溶液A):稱取7.8g二水磷酸二氫鈉用去離子水溶解定容至1L,用三氟乙酸調(diào)節(jié)pH到2.6,用0.45μm濾膜過濾后備用,溶液的最終濃度為0.05mol/L。0.1mol/L檸檬酸溶液:稱取21g一水合檸檬酸用去離子水溶解定容至1L,調(diào)節(jié)pH至4.0。0.1mol/L乙酸銨甲醇溶液:稱取7.7g乙酸銨溶解于1L甲醇溶液中。標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取一定量的大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)品,溶解于適量甲醇中,配制成100mg/L,放置于冰箱中冷凍保存(保存期:6個月),使用之前回溫到室溫。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:準(zhǔn)確稱取一定量的100mg/L大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用(1+1)甲醇水溶液逐級稀釋到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,放置于冰箱中冷凍保存(保存期:1個月),使用之前回溫到室溫。1.4檸檬酸溶液加入量先將牛奶樣品4℃4000r/min離心10min去脂肪。量取20mL去脂肪牛奶于50mL塑料離心管中,加入20mL檸檬酸溶液旋渦混合1min,振蕩10min。向混合液中加入5mL正已烷,旋渦混合1min,4000r/min離心5min,棄去正已烷,再加入5mL正已烷重復(fù)處理一次,取20mL下層水溶液于另一50mL離心管中,加入10mL正已烷,旋渦混合1min,4000r/min離心5min,棄去正已烷,水相準(zhǔn)備過柱。1.5凈化柱的制備依次用6mL甲醇、6mL檸檬酸溶液活化柱子,然后將上述樣液轉(zhuǎn)移至BondElutSCXSPE固相萃取柱上,用9mL水淋洗柱子,用6mL0.1mol/LpH9.2Na2HPO4溶液中和小住,棄去流出液。分析物用10mL0.1mol/L乙酸銨甲醇溶液洗脫并收集,洗脫液用45℃氮?dú)饬鞔蹈伞埩粑镉?.0mL0.1mol/LNa2HPO4溶液溶解,過0.45μm微孔濾膜,濾液供液相色譜測定用。1.6流速和檢測波長色譜柱:ZORBAXEclipseXDBC18柱(4.6mmi.d.×150mm,5μm);流速:1mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:50μL;檢測波長:替米考星和泰樂菌為285nm,螺旋霉素為232nm;流動相:0.05mol/LNaH2PO4溶液(A)-乙腈(B),0min22%B,15min35%B,Runtime20min,postrun5min。2結(jié)果與討論2.1離心除脂肪現(xiàn)有提取方法多為酸性提取和甲醇或乙腈提取。本研究采取4℃離心有效去掉牛奶中大部分脂肪,再用正已烷進(jìn)一步去掉脂肪。將離心后的牛奶直接加檸檬酸混勻過柱,整個提取步聚簡單,有效的減少了樣品損失及樣品分解,顯著提高了回收率。2.2色譜柱的選擇對3種大環(huán)內(nèi)酯類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行紫外可見光譜掃描,替米考星、泰樂菌素和螺旋霉素的最大吸收波長分別為285、285、232nm。研究開始時(shí)直接用0.05mol/LNaH2PO4溶液作為流動相A,不調(diào)pH,此時(shí)pH約為4.5,流動相組成為40%B,前面的色譜峰分離不好,而泰樂菌素出峰時(shí)間又太晚,超過30min。第二次經(jīng)過反復(fù)調(diào)pH,確定pH2.6時(shí)(一般的色譜柱適用的pH范圍為2～9),分離較好,出峰時(shí)間令人滿意,再經(jīng)過調(diào)整流動相的梯度,最終使3個目標(biāo)峰均與雜質(zhì)峰很好的分離,螺旋霉素、替米考星和泰東菌素出峰時(shí)間分別為:6.9、11.9、15.5min,詳見圖1。本研究中比較了日本NacalaiTesque公司的CosmosilC18-MS-Ⅱ柱,資生堂的CAPCELLPAKC18柱,安捷倫的ZORBAXEclipseXDBC18柱,規(guī)格為4.6mm×150mm,5μm和4.6mm×250mm,5μm。250mm柱出峰時(shí)間太長,選用150mm柱長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用上述3種柱均能使目標(biāo)物分離,資生堂的CAPCELLPAKC18柱峰形較好,對稱性好,但價(jià)格昂貴,最后確定用安捷倫的ZORBAXEclipseXDBC18柱,規(guī)格為4.6mm×150mm。2.3凈化效果的分析按照文獻(xiàn)方法分別使用C18固相萃取柱和SCX固相萃取柱進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用C18小柱凈化效果不佳,雜質(zhì)峰太多太大影響目標(biāo)峰的靈敏度和準(zhǔn)確定量,背景干擾非常大,根本無法檢測。而SCX柱凈化效果令人滿意,譜圖干凈,檢測靈敏度高,詳見圖2、圖3。因大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是弱堿性化合物,用pH4.0的檸檬酸使其離子化帶正電荷,易溶于水,在過柱時(shí)吸附在SCX陽離子交換柱上。用pH9.2的磷酸鹽緩沖液過柱的目的是中和SCX柱,使目標(biāo)物容易洗脫。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6mL磷酸鹽緩沖液中和正好,太少中和不完全,難于洗脫,回收率低,太多會引起目標(biāo)物穿透,回收率也會降低。最后用0.1mol/L乙酸銨甲醇溶液洗脫,加入乙酸銨的目的是增加溶液離子強(qiáng)度,使目標(biāo)物更易洗脫,提高回收率。2.4菌素檢出限及線性方程在空白牛奶中添加標(biāo)準(zhǔn)品做檢出限實(shí)驗(yàn),信噪比按3∶1計(jì)算,螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素檢出限分別為30、20、40μg/kg,線性范圍為20～800μg/kg。線性方程分別為:y=5.2418ρ-0.5913,y=5.2841ρ-0.5009,y=3.1