液相色譜法測(cè)定牛奶中替米考星、泰樂(lè)菌素和螺旋霉素的殘留量

液相色譜法測(cè)定牛奶中替米考星、泰樂(lè)菌素和螺旋霉素的殘留量

氨基硅酮、天竺葵素和螺旋霉菌屬于16位環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。該類(lèi)藥物廣泛地用作獸藥或飼料添加劑,預(yù)防和治療牛、羊、豬、雞等動(dòng)物的感染性疾病,替米考星和泰樂(lè)菌素被廣泛的加入到飼料用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑。這些藥物隨動(dòng)物性食品進(jìn)入人體后不僅會(huì)產(chǎn)生直接的毒性,還會(huì)發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)及產(chǎn)生耐藥細(xì)菌。為保護(hù)食品安全和人類(lèi)生命健康,很多國(guó)家如加拿大、歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)對(duì)該類(lèi)藥物設(shè)置了較低的最高殘留限量,如歐盟對(duì)該類(lèi)藥物最高殘留限量作了明確的規(guī)定,在肉制品中替米考星為50μg/kg,泰樂(lè)菌素為100μg/kg,螺旋霉素為200μg/kg。因此迫切需要研究一些高靈敏度、快速的方法對(duì)該類(lèi)藥殘進(jìn)行檢測(cè)監(jiān)控。國(guó)外已有一些相關(guān)檢驗(yàn)方法,如使用液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS)檢測(cè)紅霉素和螺旋霉素。國(guó)內(nèi)目前此類(lèi)藥物的相關(guān)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)缺乏,只有螺旋霉素和泰樂(lè)菌素有SN標(biāo)準(zhǔn),且都是使用微生物杯碟法,檢驗(yàn)周期長(zhǎng),靈敏度也不夠高。國(guó)內(nèi)對(duì)該類(lèi)藥物檢測(cè)方法的報(bào)道較少。1實(shí)驗(yàn)部分1.1螺旋霉素和泰樂(lè)菌素螺旋霉素(Spiramycin)、泰樂(lè)菌素(Tylosin)、替米考星(Tilmicosin)均購(gòu)自Dr.Ehrenstorfer。螺旋霉素(Spiramycin)和替米考星(Tilmicosin)純度均大于98.5%,泰樂(lè)菌素(Tylosin)純度大于95%。Na2HPO4、NaH2PO4、檸檬酸、三氟乙酸、正已烷均為分析純,甲醇和乙腈為色譜純。1.2萃取條件和萃取小柱安捷倫1100高效液相色譜儀(配有二極管陣列檢測(cè)器),離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速4500r/min),高速均質(zhì)器(最高轉(zhuǎn)速20000r/min),固相萃取裝置,固相萃取小柱:BondElutSCX苯磺酸陽(yáng)離子交換柱(3mL,500mg)或相當(dāng)者,BondElutC18柱(3mL,500mg)或相當(dāng)者,氮吹儀,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,振蕩器。1.3osol/l流動(dòng)相水相(以下簡(jiǎn)稱(chēng)溶液A):稱(chēng)取7.8g二水磷酸二氫鈉用去離子水溶解定容至1L,用三氟乙酸調(diào)節(jié)pH到2.6,用0.45μm濾膜過(guò)濾后備用,溶液的最終濃度為0.05mol/L。0.1mol/L檸檬酸溶液:稱(chēng)取21g一水合檸檬酸用去離子水溶解定容至1L,調(diào)節(jié)pH至4.0。0.1mol/L乙酸銨甲醇溶液:稱(chēng)取7.7g乙酸銨溶解于1L甲醇溶液中。標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品,溶解于適量甲醇中,配制成100mg/L,放置于冰箱中冷凍保存(保存期:6個(gè)月),使用之前回溫到室溫。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的100mg/L大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用(1+1)甲醇水溶液逐級(jí)稀釋到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,放置于冰箱中冷凍保存(保存期:1個(gè)月),使用之前回溫到室溫。1.4檸檬酸溶液加入量先將牛奶樣品4℃4000r/min離心10min去脂肪。量取20mL去脂肪牛奶于50mL塑料離心管中,加入20mL檸檬酸溶液旋渦混合1min,振蕩10min。向混合液中加入5mL正已烷,旋渦混合1min,4000r/min離心5min,棄去正已烷,再加入5mL正已烷重復(fù)處理一次,取20mL下層水溶液于另一50mL離心管中,加入10mL正已烷,旋渦混合1min,4000r/min離心5min,棄去正已烷,水相準(zhǔn)備過(guò)柱。1.5凈化柱的制備依次用6mL甲醇、6mL檸檬酸溶液活化柱子,然后將上述樣液轉(zhuǎn)移至BondElutSCXSPE固相萃取柱上,用9mL水淋洗柱子,用6mL0.1mol/LpH9.2Na2HPO4溶液中和小住,棄去流出液。分析物用10mL0.1mol/L乙酸銨甲醇溶液洗脫并收集,洗脫液用45℃氮?dú)饬鞔蹈伞埩粑镉?.0mL0.1mol/LNa2HPO4溶液溶解,過(guò)0.45μm微孔濾膜,濾液供液相色譜測(cè)定用。1.6流速和檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:ZORBAXEclipseXDBC18柱(4.6mmi.d.×150mm,5μm);流速:1mL/min;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:50μL;檢測(cè)波長(zhǎng):替米考星和泰樂(lè)菌為285nm,螺旋霉素為232nm;流動(dòng)相:0.05mol/LNaH2PO4溶液(A)-乙腈(B),0min22%B,15min35%B,Runtime20min,postrun5min。2結(jié)果與討論2.1離心除脂肪現(xiàn)有提取方法多為酸性提取和甲醇或乙腈提取。本研究采取4℃離心有效去掉牛奶中大部分脂肪,再用正已烷進(jìn)一步去掉脂肪。將離心后的牛奶直接加檸檬酸混勻過(guò)柱,整個(gè)提取步聚簡(jiǎn)單,有效的減少了樣品損失及樣品分解,顯著提高了回收率。2.2色譜柱的選擇對(duì)3種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜掃描,替米考星、泰樂(lè)菌素和螺旋霉素的最大吸收波長(zhǎng)分別為285、285、232nm。研究開(kāi)始時(shí)直接用0.05mol/LNaH2PO4溶液作為流動(dòng)相A,不調(diào)pH,此時(shí)pH約為4.5,流動(dòng)相組成為40%B,前面的色譜峰分離不好,而泰樂(lè)菌素出峰時(shí)間又太晚,超過(guò)30min。第二次經(jīng)過(guò)反復(fù)調(diào)pH,確定pH2.6時(shí)(一般的色譜柱適用的pH范圍為2～9),分離較好,出峰時(shí)間令人滿意,再經(jīng)過(guò)調(diào)整流動(dòng)相的梯度,最終使3個(gè)目標(biāo)峰均與雜質(zhì)峰很好的分離,螺旋霉素、替米考星和泰東菌素出峰時(shí)間分別為:6.9、11.9、15.5min,詳見(jiàn)圖1。本研究中比較了日本NacalaiTesque公司的CosmosilC18-MS-Ⅱ柱,資生堂的CAPCELLPAKC18柱,安捷倫的ZORBAXEclipseXDBC18柱,規(guī)格為4.6mm×150mm,5μm和4.6mm×250mm,5μm。250mm柱出峰時(shí)間太長(zhǎng),選用150mm柱長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用上述3種柱均能使目標(biāo)物分離,資生堂的CAPCELLPAKC18柱峰形較好,對(duì)稱(chēng)性好,但價(jià)格昂貴,最后確定用安捷倫的ZORBAXEclipseXDBC18柱,規(guī)格為4.6mm×150mm。2.3凈化效果的分析按照文獻(xiàn)方法分別使用C18固相萃取柱和SCX固相萃取柱進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用C18小柱凈化效果不佳,雜質(zhì)峰太多太大影響目標(biāo)峰的靈敏度和準(zhǔn)確定量,背景干擾非常大,根本無(wú)法檢測(cè)。而SCX柱凈化效果令人滿意,譜圖干凈,檢測(cè)靈敏度高,詳見(jiàn)圖2、圖3。因大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素是弱堿性化合物,用pH4.0的檸檬酸使其離子化帶正電荷,易溶于水,在過(guò)柱時(shí)吸附在SCX陽(yáng)離子交換柱上。用pH9.2的磷酸鹽緩沖液過(guò)柱的目的是中和SCX柱,使目標(biāo)物容易洗脫。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6mL磷酸鹽緩沖液中和正好,太少中和不完全,難于洗脫,回收率低,太多會(huì)引起目標(biāo)物穿透,回收率也會(huì)降低。最后用0.1mol/L乙酸銨甲醇溶液洗脫,加入乙酸銨的目的是增加溶液離子強(qiáng)度,使目標(biāo)物更易洗脫,提高回收率。2.4菌素檢出限及線性方程在空白牛奶中添加標(biāo)準(zhǔn)品做檢出限實(shí)驗(yàn),信噪比按3∶1計(jì)算,螺旋霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素檢出限分別為30、20、40μg/kg,線性范圍為20～800μg/kg。線性方程分別為:y=5.2418ρ-0.5913,y=5.2841ρ-0.5009,y=3.1