反義寡核苷酸在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

反義寡核苷酸在腫瘤治療中的研究進(jìn)展

反意義病毒對抗技術(shù)的基本原則是根據(jù)waton-crick堿性遺傳因素的互補(bǔ)規(guī)律和核電站混合原理，設(shè)計(jì)一個(gè)可與靶基因特定區(qū)域相結(jié)合的互補(bǔ)堿含量，并將特定序列的序列結(jié)合起來，以影響靶基因的表達(dá)并抑制其功能，但其他基因的記錄和表達(dá)并不受影響。封閉單個(gè)基因表達(dá)的反義的概念由Zamecnik和Stephenson首次描述,20多年來,大量研究證實(shí)了ASODN特異性抑制基因表達(dá)的能力,人們也逐漸認(rèn)識(shí)到其在疾病治療方面的巨大潛能。隨著生物技術(shù)特別是人類基因組計(jì)劃的飛速發(fā)展,反義藥物的研究引起人們的極大興趣,現(xiàn)已成為藥物研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。本文就這一方面的研究進(jìn)展作一綜述。研究表明反義寡核苷酸(ASODN)在體內(nèi)外具有特異性抑制基因表達(dá)的能力,通過相應(yīng)反義寡核苷酸對目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控,可以達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。腫瘤基因治療的實(shí)施主要包括以下三個(gè)方面:①尋找具有治療意義的目標(biāo)基因;②建立有效的靶向基因載體系統(tǒng);③發(fā)揮治療效應(yīng)。隨著DNA微陣列技術(shù)發(fā)展,腫瘤基因表達(dá)可以得到高通量檢測,并篩選出對特定腫瘤具有治療意義的目標(biāo)基因。利用反義核酸技術(shù)按同源重組原則,合成已知基因的反義寡核苷酸,與相應(yīng)的癌基因特異地結(jié)合,封閉其轉(zhuǎn)錄和翻譯,使癌基因失活。反義寡核苷酸療法已在腫瘤學(xué)研究中廣泛應(yīng)用,有些已經(jīng)進(jìn)入了實(shí)驗(yàn)和臨床階段,主要集中于癌基因和細(xì)胞因子等領(lǐng)域見表1。HSP-27:熱休克蛋白27;VEGF:血管內(nèi)皮生長因子;XIAP:X哺乳動(dòng)物凋亡蛋白抑制因子;RNR:核糖核苷酸還原酶;TGF-β2:轉(zhuǎn)化生長因子β21反之亦然雜謝劑對腫瘤細(xì)胞的影響1.1不同致病性化合物對bcl-2和骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響B(tài)cl-2基因定位于18q21,由230kb組成,在特異性(14;18)(q24;q21)染色體易位中,Bcl-2基因轉(zhuǎn)位至14號(hào)染色體免疫蛋白重鏈JH片段,從而致Bcl-2基因表達(dá)失控。Bcl-2基因主要抑制細(xì)胞凋亡,不刺激細(xì)胞增殖,在腫瘤早期,各種致癌因子使細(xì)胞內(nèi)Bcl-2基因活化和大量表達(dá),抑制致凋亡因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,為腫瘤發(fā)展提供了條件。Tortora等用Bcl-2反義寡核苷酸(Bcl-2ASODN)分別處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株GEO、卵巢癌細(xì)胞OVCAR3和乳腺癌細(xì)胞株ZR751及GEO致瘤裸鼠,結(jié)果表明,Bcl-2ASODN在體內(nèi)、外均能抑制Bcl-2表達(dá),使細(xì)胞凋亡增加。Donk等將Bcl-2ASODN與骨髓瘤細(xì)胞共同培養(yǎng),2d后Bcl-2mRNA水平下降超過75%,Bcl-2ASODN可不斷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),下調(diào)Bcl-2的表達(dá),增強(qiáng)多發(fā)骨髓瘤的治療效果。Marcucci等對老年急性白血病人連續(xù)靜脈輸注Bcl-2ASODN配合道諾霉素等化療,結(jié)果顯示Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白明顯降低,Bcl-2ASODN能增強(qiáng)化療效果,而不增加化療的副作用。1.2pkc治療腫瘤的作用機(jī)制蛋白激酶C(PKC)是一類依賴于Ca2+和磷脂的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能夠被多種生長因子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)激活,并通過使底物蛋白磷酸化產(chǎn)生多種生物效應(yīng),如激素分泌、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡及多藥耐藥等,故PKC在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖調(diào)控和腫瘤發(fā)生中起著重要作用,PKC至少有11種亞型,其中PKC-α在多種常見的惡性腫瘤中高表達(dá)。針對PKC-αmRNA的ASODN在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中,用于治療淋巴癌、卵巢癌及星狀細(xì)胞瘤等有較好的抑瘤效果,副作用較弱并可逆轉(zhuǎn)。Wang等用PKC-α反義寡核苷酸作用于人類肺癌細(xì)胞株LTEPa-2,研究顯示,ASODN明顯抑制肺癌細(xì)胞LTEPa-2增殖、克隆形成及其PKC-α蛋白表達(dá),其裸鼠的成瘤率亦明顯降低,并且發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的致癌基因(Ha-ras,c-jun,和c-fos)mRNA水平不同程度下降。1.3h-rasasodn的應(yīng)用Ras/Raf促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑,在很多腫瘤中都發(fā)現(xiàn)Ras或Raf基因的異常表達(dá),并可能是導(dǎo)致預(yù)后不良的因素之一。Fluiter等研究顯示,僅用不超過5nM的H-rasASODN就能有效降低多種腫瘤細(xì)胞株H-RasmRNA水平,抑制腫瘤細(xì)胞生長,在活體內(nèi)0.5mg/kg/天的劑量就能抑制腫瘤生長,且無毒副作用。Liao等利用人肝癌細(xì)胞株和裸鼠研究H-rasASODN對腫瘤形成、凋亡和轉(zhuǎn)移的效果,結(jié)果顯示H-rasASODN不僅在體內(nèi)外明顯抑制細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞凋亡,且能減慢裸鼠成瘤和腫瘤肺轉(zhuǎn)移。Raf為Ras的效應(yīng)基因,實(shí)驗(yàn)顯示靶向c-RafmRNA3′非翻譯區(qū)含20bp的ASODN可以有效抑制c-Raf表達(dá),且在多種腫瘤細(xì)胞株和移植瘤小鼠中表現(xiàn)出抑瘤作用。1.4asodn的抑制效果c-myc屬于原癌基因家族,參與細(xì)胞的生長、代謝、分化與凋亡,對于細(xì)胞增殖作用重要,多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中c-myc過度表達(dá)。c-mycASODN在降低乳腺癌細(xì)胞耐藥性、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞凋亡及抑制肺癌細(xì)胞生長等方面都有較好的效果,有研究顯示,c-myc暫時(shí)受抑也足以使腫瘤永久停止生長。在LNCaP,PC3和DU145三種前列腺癌細(xì)胞株培養(yǎng)液中加入c-myc反義寡核苷酸,腫瘤細(xì)胞增生受到抑制出現(xiàn)細(xì)胞死亡。1.5vegfasodn的三致實(shí)驗(yàn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種強(qiáng)有力的血管內(nèi)皮細(xì)胞促分裂因子,能增加毛細(xì)血管的通透性。許多實(shí)體瘤中VEGF高表達(dá),與腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移及預(yù)后關(guān)系密切,其表達(dá)量與腫瘤的惡性程度正相關(guān)。近年研究顯示,VEGFASODN對胰腺癌、喉癌、膀胱癌、肺癌、腎癌、肝癌等癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用。Ciardiello等用VEGFASODN處理結(jié)腸癌細(xì)胞株GEO后,發(fā)現(xiàn)VEGFASODN有效地抑制VEGF表達(dá),將GEO裸鼠成瘤,再用VEGFASODN腹腔注射3周,發(fā)現(xiàn)腫瘤生長受到抑制、瘤體內(nèi)微血管計(jì)數(shù)明顯減少。1.6caspase3活性的提高survivin基因是一種凋亡抑制基因,在腫瘤形成過程中與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增生有關(guān),survivin通過直接抑制凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最下游的效應(yīng)分子caspase3的活性,阻斷凋亡的發(fā)生過程,是某些腫瘤預(yù)后不良的標(biāo)志。針對survivin的反義核酸可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,降低腫瘤生長的能力,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。試驗(yàn)顯示,survivinASODN對肝癌、胃癌、淋巴瘤等腫瘤細(xì)胞均有較好的促凋亡作用,可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,并對化療藥有增敏作用。1.7mdr偏轉(zhuǎn)劑為反義技術(shù)多藥耐藥(mutidrugresistance,MDR)是腫瘤化療的重大障礙。傳統(tǒng)MDR逆轉(zhuǎn)劑都是作用在糖蛋白水平,效率較低,副作用大。反義技術(shù)為MDR的逆轉(zhuǎn)提供了新的策略。Wei等應(yīng)用多藥耐藥基因反義寡核苷酸與多藥耐藥白血病細(xì)胞株K562/ADM共同培養(yǎng),結(jié)果顯示細(xì)胞生長明顯受抑,凋亡增加,糖蛋白顯著下降,部分細(xì)胞耐藥基因逆轉(zhuǎn)。2asodn治療肺癌的機(jī)制目前,聯(lián)合ASODN和傳統(tǒng)化療藥物成為腫瘤研究中較為常見的策略,大量研究表明,誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡是化療藥物發(fā)揮殺傷作用的重要機(jī)制之一,而凋亡抑制基因的過度表達(dá)使腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性下降。Bcl-2家族在化療藥物誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中起重要作用,包括抑制凋亡的Bcl-2、bcl-xL基因和促進(jìn)凋亡bax、bid基因,在體外轉(zhuǎn)染針對bcl-2基因的ASODN以后,除能夠直接誘導(dǎo)急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、淋巴瘤細(xì)胞株Raji、宮頸癌細(xì)胞株Hela的細(xì)胞凋亡外,還能增加細(xì)胞株HL-60對阿糖胞苷、細(xì)胞株MCF-7對5-FU的化療敏感性,靜脈滴注bcl-2ASODN能增加難治性骨髓瘤、惡性黑色素瘤對化療的敏感性。Tolcher發(fā)現(xiàn)Bcl-2的反義寡義核苷酸可加強(qiáng)紫杉萜的抗腫瘤效應(yīng),提高雄激素非依賴性前列腺癌小鼠(PC3模型)的遠(yuǎn)期存活率。survivin具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重作用,在一些常見的惡性腫瘤中呈高度選擇性表達(dá),Olie等針對survivinmRNA設(shè)計(jì)的ASODN轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株A549,細(xì)胞增殖顯著抑制,化療藥物etoposide作用效果提高2~6倍。美國ISIS公司針對PKC-αmRNA開發(fā)出了含20bp的ASODNISIS3521,ISIS3521與卡鉑和紫杉醇合用的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn),經(jīng)聯(lián)合治療的24例小細(xì)胞肺癌患者的1年生存率為78%,其中平均生存期為18月。相比之下,單純化療的患者生存期為8月。Riedel等研究顯示VEGFASODN通過降低VEGF表達(dá)減輕細(xì)胞株HNSCC的耐藥性,加強(qiáng)順鉑、卡鉑和5-FU對的作用。3反義基因的設(shè)計(jì)長期以來,人們知道通過阻斷mRNA活動(dòng),封閉特異性目的基因表達(dá)以達(dá)到基因沉默,是利用基因組學(xué)知識(shí)發(fā)展新藥的理想策略。反義核酸技術(shù)作為基因治療的一種方法,已經(jīng)在腫瘤研究方面取得了較快的進(jìn)展,當(dāng)然,反義技術(shù)要真正應(yīng)用于腫瘤的臨床治療,還有一些問題尚需解決。比如:細(xì)胞癌變并非一個(gè)基因變異所致,是多個(gè)相關(guān)基因共同作用的結(jié)果,而反義技術(shù)一般只能特異地抑制一個(gè)基因,同時(shí)抑制多個(gè)癌基因表達(dá)的反義技術(shù)還有待進(jìn)一步的研究;如何最大限度地提高靶細(xì)胞對ODNs的攝取率,ODNs的體內(nèi)抑制效率如何,體內(nèi)應(yīng)用有否顯著的副作用以及從實(shí)驗(yàn)向臨床過渡涉及的藥物合成、劑量和安全性問題;另外,針對靶基因的哪一段來設(shè)計(jì)反義序列最有效,也是一個(gè)需要重點(diǎn)研究的問題。雖然小