腸缺血再灌注對(duì)sd大鼠肝臟損傷的影響及機(jī)制研究

腸缺血再灌注對(duì)sd大鼠肝臟損傷的影響及機(jī)制研究

腸缺血性再感染（iir）除腸道損傷外，也是全身炎癥反應(yīng)和多器官衰竭的重要原因1-2。由于接受來自腸道的雙重血液供應(yīng),肝臟是腸缺血再灌注最先受累的遠(yuǎn)隔臟器,而其本身具有巨大的內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞庫,可能成為失控炎癥反應(yīng)過程中多種炎癥介質(zhì)的源泉［3-4］。腸缺血再灌注后可能會(huì)導(dǎo)致急性肝功能障礙［3］。目前研究證明氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)的激活及失控性釋放等是腸缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一［5-6］,大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腸源性內(nèi)毒素血癥是腸缺血再灌注致遠(yuǎn)隔器官損傷的主要原因,但由于腸源性毒性物質(zhì)眾多,腸缺血再灌注引起繼發(fā)性早期肝損傷的具體發(fā)生機(jī)制目前仍不明確。肥大細(xì)胞廣泛分布于全身結(jié)締組織中,尤以皮膚、呼吸道、消化道黏膜下層結(jié)締組織中居多,正常情況下肥大細(xì)胞很少分布于人/鼠類肝臟,而在肝硬化晚期肝臟中可見肥大細(xì)胞數(shù)目急劇增加［7］。肥大細(xì)胞受刺激時(shí),以胞吐方式大量釋放顆粒內(nèi)的物質(zhì)(常稱為脫顆粒),主要介質(zhì)包括組胺、類胰蛋白酶、類糜蛋白酶、肝素和細(xì)胞因子等,在病理狀態(tài)下產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。組胺是由肥大細(xì)胞脫顆粒釋放的胺類物質(zhì),通過與組胺受體結(jié)合參與過敏、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、促進(jìn)胃酸分泌、維持內(nèi)皮功能等。Kalia等［8］通過腸缺血前3d連續(xù)經(jīng)胃灌注組胺拮抗劑酮替酚,可提高大鼠再灌注后生存率。Zhao等［9］的研究表明,可通過核因子E2相關(guān)因子2-抗氧化反應(yīng)元件(nuclearfactorE2-relatedfactor2-antioxidantresponseelement,Nrf2-ARE)信號(hào)通路增強(qiáng)抗氧化能力,從而減輕腸缺血再灌注導(dǎo)致的繼發(fā)性肝損傷。Cámara-Lemarroy等［10］報(bào)道抑制腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)表達(dá)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)可能對(duì)腸缺血再灌注后腸道、肺和肝損傷具有保護(hù)作用。以肥大細(xì)胞為靶點(diǎn)防治腸缺血再灌注后腸、肺損傷已有報(bào)道,并證明了抑制肥大細(xì)胞脫顆粒能減輕腸缺血再灌注損傷,但這些處理對(duì)繼發(fā)性早期肝損傷的影響尚不明確。本研究的主要目的是通過藥物干預(yù)肥大細(xì)胞功能,觀察色甘酸鈉(肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑)、酮替酚(組胺H1受體拮抗劑)和compound48/80(肥大細(xì)胞脫顆粒劑)于腸缺血后再灌注前靜脈應(yīng)用對(duì)腸缺血再灌注繼發(fā)性肝損傷的影響,并從肝臟功能性和病理性改變、血清組胺水平、肝細(xì)胞因子的變化、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等方面探討肥大細(xì)胞在腸缺血再灌注致早期肝損傷中的可能機(jī)制,以及分析血漿肝功能水平與組胺、肝細(xì)胞因子及氧化指標(biāo)的關(guān)系,為肥大細(xì)胞為靶點(diǎn)的藥物治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料和方法1氨基酸質(zhì)控活性試劑盒色甘酸鈉(ICNPharmaceuticals),酮替酚和com-pound48/80(Sigma),TNF-α、白細(xì)胞介素8(interleu-kin-8,IL-8)和組胺ELISA試劑盒(R&D),BCA組織總蛋白提取試劑盒(凱基生物公司),乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性試劑盒(南京建成生物工程公司)。2分組及分組中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的35只清潔級(jí)雄性SD大鼠,體重180~270g。按基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)1周,室溫25~27℃,適應(yīng)環(huán)境后,按體重隨機(jī)分為5組,每組7只:假手術(shù)(shamoperation,S)組、IR組、IR+C組(缺血再灌注+色甘酸鈉25mg/kg)、IR+K組(缺血再灌注+酮替芬1mg/kg)和IR+CP組(缺血再灌注+compound48/800.75mg/kg)。色甘酸鈉、酮替芬和compound48/80劑量參照我們以往的研究所用劑量［8，11-12］。3動(dòng)脈夾并進(jìn)行模型復(fù)制模型建立參照我們以往研究,5組大鼠均于術(shù)前16h禁食,自由飲水。腹腔注射10%水合氯醛3.5mL/kg麻醉后,仰臥位固定,消毒鋪巾,腹部正中切口進(jìn)腹,分離腸系膜上動(dòng)脈。S組只分離腸系膜上動(dòng)脈,不阻斷;其余4組用無損傷動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈根部,75min后松開動(dòng)脈夾,模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)為缺血處腸系膜微動(dòng)脈搏動(dòng)消失;且再灌注前腸道淤黑、腫脹;動(dòng)脈夾松開后缺血處腸系膜微動(dòng)脈恢復(fù)搏動(dòng)。IR+C、IR+K和IR+CP組分別在再灌注前5min經(jīng)尾靜脈注射色甘酸鈉、酮替芬或com-pound48/80;S和IR組分別給予等量生理鹽水。然后縫合腹膜、肌肉和皮膚,放于37℃恒溫箱保溫,自由飲水。4肝組織相關(guān)指標(biāo)和生化指標(biāo)的檢測(cè)4.1標(biāo)本處理分別在再灌注4h時(shí)斷頭處死各組大鼠,動(dòng)物處死后立即取肝左內(nèi)側(cè)葉用10%甲醛固定,用于光鏡病理觀察。肝右葉標(biāo)本冷生理鹽水沖洗,裝入凍存管液氮快速冰凍,-80℃保存?zhèn)溆?。肝組織150mg制作組織勻漿,以4000r/min離心15min,取上清液以BCA法測(cè)定組織總蛋白濃度。同時(shí),動(dòng)物處死后立即取2mL下腔靜脈血,分離血漿取上清液放于-70℃冰凍保存。4.2血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanineaminotrans-ferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateamin-otransferase,AST)和組胺水平檢測(cè)血清ALT和AST的檢測(cè)使用全自動(dòng)生化分析儀,單位以U/L表示。采用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠血清組胺濃度。按試劑盒操作說明進(jìn)行。4.3肝組織病理學(xué)損傷的評(píng)價(jià)采用盲法在光鏡下觀察其病理學(xué)變化,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)視野取平均值作為每個(gè)標(biāo)本的評(píng)分值。肝組織損傷分級(jí)和評(píng)分采用如下標(biāo)準(zhǔn)［13］:0分:肝小葉、肝細(xì)胞、肝細(xì)胞索、中央靜脈、肝竇均正常;1分:少見肝細(xì)胞變性,匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞聚集;2分:肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血,散在肝細(xì)胞變性、壞死,肝組織內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集較多,肝小葉結(jié)構(gòu)完整;3分:肝中央靜脈、肝竇內(nèi)瘀血,廣泛肝細(xì)胞變性、壞死,大量炎癥細(xì)胞聚集,部分肝小葉破壞不完整。4.4肝組織LDH活性檢測(cè)采用組織全LDH活性試劑盒測(cè)定肝組織LDH活性。按試劑盒操作說明進(jìn)行。4.5肝組織TNF-α和IL-8濃度檢測(cè)采用ELISA試劑盒測(cè)定大鼠肝組織勻漿TNF-α和IL-8濃度。按試劑盒操作說明進(jìn)行。4.6肝組織超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。按照操作程序分別在測(cè)定管、對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)的試劑及樣品,混勻,置37℃恒溫水浴40min,加入顯色劑,混勻,室溫放置10min,于波長(zhǎng)550nm處,1cm光徑比色杯,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管吸光度值。根據(jù)吸光度值算出肝組織勻漿中SOD活力。采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定MDA含量。按照操作程序分別在標(biāo)準(zhǔn)管、標(biāo)準(zhǔn)空白管、測(cè)定管、測(cè)定空白管加入對(duì)應(yīng)的試劑和樣品,混勻,95℃水浴40min,取出后流水冷卻,然后3500~4000r/min離心10min。取上清1mL,532nm處,1cm光徑,蒸餾水調(diào)零,測(cè)各管吸光度值。根據(jù)吸光度值算出肝組織勻漿中MDA含量。5單因素方差分析數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件處理。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA),采用SNK法進(jìn)行組間的兩兩比較。血漿組胺水平、肝TNF-α、IL-8、MDA濃度、SOD活性與血漿AST水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1一般數(shù)據(jù)各組大鼠的體重、體表面積等一般情況無顯著差別(P>0.05)。2血清alt和ast水平與S組相比,其余各組的血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.05);與IR組相比,IR+C和IR+K組的血清ALT和AST水平明顯降低(P<0.05),IR+CP組的血清ALT和AST水平明顯增高(P<0.05),見圖1A、B。與S組相比,各組的血清組胺濃度明顯升高(P<0.05);與IR組相比,IR+C和IR+K組的血清組胺濃度明顯降低(P<0.05),IR+CP組的血清組胺含量明顯增高(P<0.05),見圖1C。3病理組織學(xué)檢測(cè)光學(xué)顯微鏡觀察可見,S組肝細(xì)胞排列整齊,胞漿染色均勻,肝血竇清晰且無明顯擴(kuò)張,匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常;IR組和IR+CP組表現(xiàn)肝細(xì)胞腫脹,胞漿淡染,肝血竇不規(guī)則有少量充血,匯管區(qū)血管充血、擴(kuò)張;而IR+C和IR+K組與IR組相比,表現(xiàn)為肝細(xì)胞腫脹明顯減輕,胞漿染色較勻,肝細(xì)胞的排列較整齊,肝血竇清楚,匯管區(qū)血管充血、擴(kuò)張明顯減輕。病理形態(tài)學(xué)積分,與S組相比,各組的病理評(píng)分明顯增加(P<0.05);與IR組相比,IR+C和IR+K組的病理評(píng)分降低(P<0.05),而IR+CP組的病理評(píng)分增加(P<0.05),見圖2。4各變量表1與S組相比,其余各組的TNF-α和IL-8濃度明顯升高(P<0.05);與IR組相比,IR+CP組的肝組織TNF-α和IL-8濃度明顯升高(P<0.05),而IR+C、IR+K組的肝組織TNF-α和IL-8濃度明顯降低(P<0.05),見圖3A、B。5各變量表1與S組相比,各組的肝組織MDA濃度明顯升高,SOD活性降低(P<0.05);與IR組相比,IR+C和IR+K組的肝組織MDA濃度明顯降低,SOD活性升高(P<0.05),IR+CP組的肝組織MDA含量明顯增高,SOD活性降低(P<0.05),見圖3C、D。6各變量表1與S組相比,各組的肝組織LDH活性明顯升高(P<0.05);與IR組相比,IR+C和IR+K組的肝組織LDH活性明顯降低(P<0.05),IR+CP組的肝組織LDH活性明顯升高(P<0.05),見圖3E。7mda和mda含量的相關(guān)性血清AST水平與血清組胺水平呈正相關(guān)(r=0.757,P<0.01),與肝組織TNF-α含量呈正相關(guān)(r=0.893,P<0.01),與肝組織IL-8含量呈正相關(guān)(r=0.859,P<0.01),與肝組織MDA含量呈正相關(guān)(r=0.836,P<0.01),與肝組織SOD活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.793,P<0.01)。腸活檢中的氧化應(yīng)激在腸、肺、心臟和腦缺血再灌注損傷的研究中,以肥大細(xì)胞為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)減輕缺血再灌注損傷取得了一定效果,證實(shí)有可能是一種有前景的方法［8，14-16］。早期在急性胰腺炎引起繼發(fā)性肺損傷的研究中,應(yīng)用肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉干預(yù)肥大細(xì)胞功能,也證實(shí)肥大細(xì)胞可能通過增加中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子1(inter-cellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)的表達(dá)來促進(jìn)白細(xì)胞的活化,啟動(dòng)遠(yuǎn)隔器官損傷［17］。我們的前期研究證明了缺血后給予色甘酸鈉、酮替芬能減輕腸缺血再灌注損傷,提高動(dòng)物存活率;而使用肥大細(xì)胞脫顆粒劑compound48/80則加重腸缺血再灌注損傷,使動(dòng)物存活率降低［12］。在本次研究中,我們發(fā)現(xiàn)腸缺血再灌注后肝臟出現(xiàn)繼發(fā)性損傷,伴隨血清ALT、AST水平和肝臟LDH活性升高,給予色甘酸鈉、酮替芬能減輕肝臟病理性及功能性損傷,使用compound48/80則加重肝損傷。提示腸缺血后給予色甘酸鈉、酮替芬能減輕再灌注后肝臟早期損傷,使用肥大細(xì)胞脫顆粒劑compound48/80則起相反作用。組胺是肥大細(xì)胞釋放的主要活性物質(zhì)之一,能增加血管通透性,誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),刺激上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,引起或加重組織損傷,同時(shí)能進(jìn)一步誘發(fā)肥大細(xì)胞活化。組胺拮抗劑被廣泛應(yīng)用于缺血再灌注的保護(hù),有學(xué)者報(bào)道通過腸缺血前3d連續(xù)經(jīng)胃灌注酮替酚可提高大鼠生存率［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)腸缺血再灌注后血清組胺含量增高,給予色甘酸鈉、酮替芬處理后血清組胺含量減少,而使用com-pound48/80則增加組胺含量。同時(shí)相關(guān)分析結(jié)果表明血清組胺含量與血清AST水平呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示腸缺血再灌注后腸源性肥大細(xì)胞被激活,并釋放大量活性物質(zhì)進(jìn)入血液系統(tǒng),其中組胺可能是造成遠(yuǎn)隔器官肝臟損傷的原因之一。腸缺血后再灌注肝損傷的研究發(fā)現(xiàn),腸道內(nèi)的毒性物質(zhì)及腸道組織缺氧產(chǎn)生的反應(yīng)性氧化中介因子可以誘導(dǎo)肝臟的氧化損傷［9］。有研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可加重氧化損傷,肥大細(xì)胞激活促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基產(chǎn)生,促使SOD活性降低,MDA水平增高［18］。我們的研究顯示應(yīng)用色甘酸鈉抑制肥大細(xì)胞脫顆粒、應(yīng)用酮替芬拮抗組胺效應(yīng),均