色甘酸鈉對黃土鼠腦缺血再灌注后腦保護(hù)作用及腦組織腫瘤壞死因子-和白細(xì)胞介素-1水平的影響

色甘酸鈉對黃土鼠腦缺血再灌注后腦保護(hù)作用及腦組織腫瘤壞死因子-和白細(xì)胞介素-1水平的影響

干預(yù)后腎衰竭的可能機(jī)制非常復(fù)雜，如鈣超載和氧氣自由基的作用。研究顯示腦缺血再灌注后,腦組織TNF-α和IL-1β水平顯著增高,是造成腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。有研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞除釋放組胺外,還具有釋放TNF-α和IL-1β或誘發(fā)其它細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β的作用。色甘酸鈉是肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑,能減少肥大細(xì)胞脫顆粒。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)色甘酸鈉能減輕腸缺血再灌注損傷,因而,推測該藥物在腦缺血/再灌注損傷方面可能也能發(fā)揮其抗炎特性而減輕損傷、保護(hù)腦組織。本研究擬復(fù)制沙土鼠全腦缺血/再灌注模型,觀察色甘酸鈉對缺血/再灌注后腦的保護(hù)作用和腦組織TNF-α和IL-1β水平的影響。1材料和方法1.1模型再灌注組模型健康、雄性清潔級蒙古沙土鼠24只,質(zhì)量55~70g,由浙江省實驗動物中心提供,合格證號:0001382。實驗前均在衛(wèi)生的環(huán)境中飼養(yǎng),自由攝食、飲水。動物隨機(jī)分為3組,每組各8只。A組:假手術(shù)對照組(對照組),游離雙側(cè)頸總動脈但不阻斷腦血流。B組:腦缺血再灌注組(模型組),游離雙側(cè)頸總動脈并阻斷腦血流,10min后開放動脈,2h后取材。C組:模型+色甘酸鈉組(色甘酸鈉組),開放動脈后即經(jīng)舌靜脈注入色甘酸鈉50mg/kg的一半劑量,1h后再次注入另一半劑量,再過1h后取材。3%戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉,將動物仰臥在實驗臺上,剪開頸部正中皮膚,分離雙側(cè)頸總動脈、套線,然后用微動脈夾同時阻斷雙側(cè)頸總動脈血流造成腦缺血,檢查遠(yuǎn)端血流情況以確保完全阻斷血流。腦缺血時間為10min,松開動脈夾恢復(fù)腦血流即為再灌注。對照組僅游離雙側(cè)頸總動脈但不阻斷腦血流。1.2切片、觀察方法斷頭處死動物,快速取出腦組織并取丘腦約1cm3,10%甲醛固定,病理切片(bregma-2.80to-3.16mm),HE染色,光鏡觀察。剩余腦組織正中矢狀切分左右大腦,左側(cè)制成組織勻漿,-40℃保存,測定TNF-α、IL-1β,右側(cè)腦組織取出用于腦組織含水量測定。1.3腦含水量測定右側(cè)腦組織取出,迅速吸盡表面水分,分析天平稱取濕重后放入105℃恒溫烤箱中烘烤48h后稱取干重,計算腦組織含水量。腦組織含水量:用Eliot公式計算腦組織含水量:含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%1.4病理檢查在光鏡下觀察腦組織病理損傷情況。1.5tnf和il1測量腦組織勻漿后采用ELISA方法測定TNF-α和IL1-β,試劑由武漢博士德提供(產(chǎn)品編號:EK0525和EK0392)。1.6統(tǒng)計處理采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1色甘酸鈉組的細(xì)胞壓見圖1。模型組腦組織損傷明顯,光鏡下見大片液化壞死區(qū)域,神經(jīng)元壞死性變性,胞核固化、溶解、消失,細(xì)胞周邊呈扇形空泡改變;色甘酸鈉組損傷較輕,大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常,少數(shù)神經(jīng)元胞核固縮,胞漿水腫;對照組腦組織均勻,神經(jīng)元排列整齊、致密,胞核無固縮、變形,胞漿無水腫。2.2腦組織的含水量模型組和色甘酸鈉組高于正常對照組(P<0.05),色甘酸鈉組低于模型組(P<0.05),見表1。2.3腦癱tnf-i3組中模型組TNF-α水平最高(P<0.05);色甘酸鈉組和對照組無明顯差別(P>0.05),見表1。2.4l-1水平與對照組比較,模型組和色甘酸鈉組IL-1β水平升高(P<0.05);與模型組相比,色甘酸鈉組IL-1β含量明顯下降(P<0.05),見表1。3對大鼠腸活檢損傷的影響TNF-α和IL-1β是具有多種生物活性的多肽類細(xì)胞因子,當(dāng)腦組織受到缺血再灌注損傷時,可由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。它們是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要炎癥因子,可加重腦缺血再灌注部位的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后神經(jīng)組織中TNF-αmRNA及IL-1βmRNA的表達(dá)明顯增加,血清中TNF-α和IL-1β的含量明顯升高。TNF-α和IL-1β在腦組織易損區(qū)表達(dá)增多,參與了腦組織的損傷,雖然二者升高的時間和程度不盡一致,但均顯示與腦缺血再灌注損傷的直接相關(guān)。本試驗中我們發(fā)現(xiàn),TNF-α和IL-1β含量以模型組最高,模型組腦組織含水量顯著高于另外兩組,光鏡下模型組腦組織損傷最重,出現(xiàn)大片液化壞死區(qū)域,神經(jīng)元壞死性變性,胞核固化、溶解、消失,細(xì)胞周邊呈扇形空泡改變。我們的研究結(jié)果同樣證實了TNF-α和IL-1β參與了腦缺血再灌注損傷。近來有一些研究發(fā)現(xiàn),肥大細(xì)胞通過脫顆粒釋放的組胺、五羥色胺、IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)加劇組織損傷。Silver等發(fā)現(xiàn)腦缺血后可引起肥大細(xì)胞脫顆粒,改變血腦屏障的通透性,促使白細(xì)胞遷移入腦內(nèi),加重炎癥反應(yīng)和組織水腫。胡薇薇等研究發(fā)現(xiàn)在全腦缺血5min再灌注損傷后1h和7d后,丘腦肥大細(xì)胞脫顆粒比例呈明顯增加,可能參與了全腦缺血再灌注損傷。色甘酸鈉是一種抗變態(tài)反應(yīng)藥物,其作用機(jī)制是能穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜,阻止肥大細(xì)胞脫顆粒,從而抑制組胺、TNF-α、IL-1β等炎性介質(zhì)的釋放。甘小亮等發(fā)現(xiàn),色甘酸鈉能抑制腸粘膜肥大細(xì)胞活性,減少TNF-α等炎性介質(zhì)的釋放,從而減輕大鼠腸缺血再灌注損傷。本次實驗發(fā)現(xiàn),色甘酸鈉組TNF-α、IL-1含量顯著下降,腦含水量與模型組相比亦顯著下降,光鏡下色甘酸鈉組損傷較輕,大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常,少數(shù)神經(jīng)元胞核固縮,胞漿水腫。研究結(jié)果進(jìn)一步提示肥大細(xì)胞