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5-h終末、腦初級傳入終末在孤束核內(nèi)與向臂旁核上映射的神經(jīng)元
5-羥色胺(5-ht)是腦內(nèi)源性神經(jīng)活動的抑制劑,通常被認為會抑制外部引入的有害信息。腦干內(nèi)含5-HT的神經(jīng)元主要分布于中縫諸核團和中腦中央灰質(zhì)。大量生理學的研究已經(jīng)證明,5-HT能的下行抑制系統(tǒng)對脊髓和延髓背角的軀體傷害性傳入信息實施抑制性調(diào)控。相應(yīng)的形態(tài)學研究也觀察到腦干內(nèi)含5-HT的神經(jīng)元發(fā)出的下行性纖維直接投射至脊髓和延髓背角淺層并與其中的中間神經(jīng)元以及投射神經(jīng)元形成突觸連接。孤束核(NTS)也是周圍神經(jīng)傳入的門戶,但它主要接受并中繼經(jīng)IX、X顱神經(jīng)傳遞的,支配頸、胸、腹部內(nèi)臟器官傳入信息,少量來自Ⅸ、Ⅹ顱神經(jīng)的軀體性成分和來自三叉神經(jīng)幾個支配口、鼻腔粘膜的被認為是軀體性成分的纖維也投射到NTS。同時,還有的研究證明,NTS與腦干內(nèi)組成下行抑制系統(tǒng)的核團之間存在往返纖維聯(lián)系;NTS內(nèi)臟神經(jīng)初級傳入分布區(qū)也有密集的5-HT終末分布。近年來的研究結(jié)果顯示,腦干內(nèi)參與組成下行性抑制系統(tǒng)含5-HT的多數(shù)核團發(fā)出纖維直接投射至NTS。至NTS下行性的5-HT軸突終末也可能如同至脊髓、延髓背角淺層者一樣,與NTS內(nèi)的向上位腦結(jié)構(gòu)投射的神經(jīng)元之間存在突觸聯(lián)系。中樞內(nèi)NTS傳出投射廣泛,但最主要的傳出投射區(qū)當屬臂旁核(PBN)。本研究用羅丹明逆行標記NTS向PBN投射的神經(jīng)元,并且以不同激發(fā)和吸收波長的熒光素分別顯示了內(nèi)臟神經(jīng)初級傳入和5-HT終末,在激光共聚焦掃描顯微鏡(LSCM,Bio-RadMRC-1024)下觀察了兩種終末與NTS投射神經(jīng)元的關(guān)系,其目的在于探索兩種終末是否匯聚于此投射神經(jīng)元,為進一步闡明此投射神經(jīng)元對兩種來源的信號進行整合的機制奠定形態(tài)學基礎(chǔ)。橋腦支撐前hs-pcr檢測成年雄性大鼠(250~280g)15只,腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40mg/100g體重)麻醉。在Narishige定位儀上,用尖端套微玻管的微量注射器(1μl,按照PaxinosandWatson的圖譜)向PBN的外側(cè)部(PBL)注射四甲基羅丹明(tetramethylrhodamineTMR,MolecularProbes)溶液(10%,incitrate-NaOH,0.1mol/L,pH3.0)0.3~0.5μl。注射完畢將動物置于仰臥位。暴露顱底頸靜脈孔處的舌咽和迷走神經(jīng)干。借助手術(shù)顯微鏡以尖端磨細的微量注射器(10μl)向舌咽和迷走神經(jīng)干內(nèi)分別注射1~1.2μl的生物素化葡聚糖胺(biotinylateddextran-amineBDA,molecularprobes)溶液(10%,insaline)。動物存活7d后,在深度麻醉下,經(jīng)升主動脈先以生理鹽水沖洗,繼以含4%多聚甲醛,0.2%苦味酸的磷酸緩沖液(PB,0.1mol/L,pH7.2~7.4)灌流固定0.5~1h。取腦,置入含30%蔗糖的PB液(4℃)過夜后,先取含PBN的橋腦吻段腦干冰凍切片,在熒光顯微鏡下檢查注射區(qū)。選注射區(qū)準確,范圍局限的材料,制作閂平面附近的腦干橫位連續(xù)冰凍切片,片厚10~15μm。切片以PBS(0.01mol/L,pH7.2~7.4)漂洗后依次入下述孵育液進行免疫熒光和熒光組織化學反應(yīng),步驟如下。①豚鼠抗TMR(1∶100,李金蓮副教授惠贈)和兔抗5-HT(1∶2000,INC)的IgG抗血清混合液中震蕩孵育48h;②標記TMR的山羊抗豚鼠(1∶200,Chemicon)和標記CY5(indodicarbocyanine,Pittsburgh,PA)的羊抗兔(1∶200,Chemicon)IgG抗血清以及Avidin-FITC(1∶200,Vector)的混合液中震蕩孵育4h。孵育液均以含0.2%TritonX-100,1%的正常驢血清和0.03%的NaN3的PBS配制,置換孵育液時和孵育后的切片均以PBS充分漂洗。操作在室溫下進行,盡量避光。裱片、干燥后以2.5%三乙烯二胺(triethylenediamine,inPBS)和等量甘油的混合液封片。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察,用于激發(fā)FITC、TMR和CY5的激光束波長分別為488、543和650nm,用于圖象采集的顯微鏡物鏡為Plan-Neofluar40×油浸鏡。分別或同時以PBS代替-抗的對照實驗結(jié)果均為陰性。連合核標記細胞FITC,TMR和CY5分別發(fā)出綠、紅和藍色熒光。經(jīng)加強后的紅色TMR標記產(chǎn)物充滿逆行標記細胞的胞體和樹突。樹突長短不一,長者可超過100μm(Figs.1,4,5,6)。除注射區(qū)對側(cè)有少量標記細胞外,大量的逆行標記細胞見于注射側(cè)的NTS,最密集處位于閂平面附近的孤束內(nèi)側(cè)區(qū),包括內(nèi)側(cè)亞核、小細胞亞核和連合核等。連合核的標記細胞為梭形,突起多為水平走向,部分突起越過中線延伸至對側(cè)。其余部位標記細胞的形態(tài),突起排列方向不定。標記細胞均屬中、小型,鮮見大于20μm以上者。除逆行標記細胞外,還可見紅色的順行標記纖維和終末(Fig.1)。被FITC標記的舌咽、迷走神經(jīng)至NTS的初級傳入終末呈綠色點、塊狀,分布區(qū)域與TMR細胞和終末標記區(qū)基本一致(Fig.3)。藍色的5-HT陽性標記的點狀終末區(qū)范圍較大(Fig.2),涵蓋前二者標記分布區(qū)。三種標記顯示了清楚的重疊關(guān)系(Figs.4,5,6)。在逆行標記神經(jīng)元胞體和樹突周圍,可見內(nèi)臟神經(jīng)初級傳入終末和5-HT終末。綠、藍兩種點狀終末及膨體貼近逆行標記細胞胞體和樹突,形成較緊密接觸(Figs.5,6)。樹突的這種緊密接觸點多于胞體者。另一些點狀終末及膨體則貼附于標記細胞胞體和樹突之上,其重疊處熒光顏色發(fā)生相應(yīng)的改變(Figs.5,6)。另外,內(nèi)臟神經(jīng)初級傳入、5-HT和來自PB順行標記終末的綠、藍和紅色點狀膨體相互間也存在接觸及重疊現(xiàn)象,三種終末濃密重疊處甚至還原成白色熒光(Fig.4)。精神內(nèi)部c-fos、nts內(nèi)神經(jīng)元/傳導(dǎo)通路及其連接由受體介導(dǎo)的5-HT可抑制脊髓、延髓背角淺層的傷害性傳入信息。迄今,運用放射自顯影、原位分子雜交以及免疫組織化學方法在神經(jīng)系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)5-HT受體的7種類型及其14個亞型,其中5-HT3型為離子門控型,其余均為G蛋白偶聯(lián)型受體。雖然受體的多樣性反映了其介導(dǎo)5-HT作用的復(fù)雜性,但在脊髓背角水平上,基本方式不外乎抑制興奮性中間神經(jīng)元、興奮抑制性中間神經(jīng)元或直接抑制傳遞傷害性信息的投射神經(jīng)元。含5-HT的下行抑制系統(tǒng)可能以相同方式作用于NTS神經(jīng)元,對內(nèi)臟活動和內(nèi)臟傳入信息產(chǎn)生抑制影響。NTS接受外周內(nèi)臟感覺信息傳入有明確的定位關(guān)系。其吻段主要與味刺激傳入;中尾段的腹外、中間內(nèi)側(cè)亞核主要與呼吸器官;而背內(nèi)、膠質(zhì)、小細胞、內(nèi)側(cè)亞核、連合核則主要與胃腸、心血管的感覺信息傳入有關(guān)。至NTS的舌咽、迷走神經(jīng)雖主要傳遞與內(nèi)臟初級傳入信息,但其中部分初級傳入纖維則可傳遞內(nèi)臟傷害性刺激信息。如迷走神經(jīng)對心肌缺血或壞死而引發(fā)的心絞痛刺激信息的傳遞。電刺激迷走神經(jīng)干和福爾馬林導(dǎo)入大鼠胃內(nèi)能分別引起NTS內(nèi)c-fos、NGFI-AmRNA和FOS蛋白的表達。這些基因和FOS蛋白在NTS內(nèi)的表達部位與支配胃腸、心血管的內(nèi)臟神經(jīng)初級傳入終末分布區(qū)一致,即主要涉及NTS的小細胞、內(nèi)側(cè)亞核和連合核等。該部NTS的傳出纖維向上位中樞的投射,主要終止于PBL的外外(externallateral)、外內(nèi)(externalmedial)以及中央亞核和背內(nèi)亞核等。以緩激肽(bradykinin)刺激大鼠腹膜腔的電生理學研究證明,PBL的外外和外內(nèi)亞核是胃腸、心血管內(nèi)臟傷害性傳入的調(diào)控和中繼以及內(nèi)臟和軀體傳入的匯聚部位。本實驗涉及的外外、外內(nèi)亞核的注射區(qū)在NTS內(nèi)的逆行標記細胞分布與以往研究結(jié)果大體一致。此結(jié)果提示經(jīng)NTS的小細胞、內(nèi)側(cè)亞核和連合核內(nèi)神經(jīng)元投射至PBL的外外、外內(nèi)亞核可能為一條傳遞胃腸、心血管傷害性內(nèi)臟信息的傳導(dǎo)通路。本研究發(fā)現(xiàn)Ⅸ、Ⅹ腦神經(jīng)初級傳入終末與逆行標記細胞和樹突的緊密接觸,可能是內(nèi)臟神經(jīng)初級傳入終末與NTS內(nèi)向PBL投射的神經(jīng)元之間的突觸連接點,進一步為該通路的存在提供了直接證據(jù)。同樣,5-HT陽性標記終末與逆行標記神經(jīng)元和樹突間的緊密接觸可能也是突觸連接部位。說明含5-HT能的下行抑制系統(tǒng)可能以直接作用于NTS內(nèi)投射神經(jīng)元的形式,對包括傷害性的內(nèi)臟傳入
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