大鼠腸缺血再灌注肺損傷模型的肥大細(xì)胞因素研究進(jìn)展

大鼠腸缺血再灌注肺損傷模型的肥大細(xì)胞因素研究進(jìn)展

腸球菌病的發(fā)生通常發(fā)生在傷口的救援過程中。腸缺血/再灌注過程中產(chǎn)生許多有毒的氧自由基造成細(xì)胞膜的損害,引起遠(yuǎn)隔器官的損害,其中以肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合征最為突出。Kasacka等通過大鼠實(shí)驗(yàn)性失血性休克/再灌注肺損傷模型,觀察到肺泡滲出液中含有大量的肥大細(xì)胞,推測腸缺血/再灌后致肺損傷可能與肺內(nèi)肥大細(xì)胞的增多有一定關(guān)系。色甘酸鈉作為肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑,能夠穩(wěn)定肥大細(xì)胞,避免其活化脫顆粒;另有報(bào)道表明色甘酸鈉能夠減輕放射性肺損傷。本研究擬觀察色甘酸鈉對腸缺血/再灌注大鼠肺損傷的影響及其機(jī)制,為臨床研究提供參考。1材料和方法1.1eckman-auegra的光鏡BL-420E智能型生物信號(hào)處理系統(tǒng)(泰盟電子制造),Heidolph×900勻漿機(jī)(德國),離心沉淀機(jī)(BeckmanAuegra64R,美國),酶標(biāo)儀(Bio-RadModel680,美國),CH30光鏡(OLYMPUS公司,日本)。試劑:色甘酸鈉(ICN,美國),大鼠組胺試劑盒(RapidBioLab,美國),MDA、SOD試劑盒(南京建成),組織蛋白濃度測定試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司),其他為國產(chǎn)分析純試劑。1.2大鼠腸動(dòng)脈內(nèi)動(dòng)脈采血模型健康清潔級SD大鼠32只(中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):0011023),體重200g~250g,雌雄各半,隨機(jī)分為四組,每組8只:假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、色甘酸鈉1組(模型+色甘酸鈉50mg/kg,C組)及色甘酸鈉2組(模型+色甘酸鈉25mg/kg,D組)。四組大鼠均于術(shù)前16h禁食,自由飲水。腹腔注射3%戊巴比妥鈉45mg/kg麻醉后,仰臥位固定,行氣管切開,然后行頸總動(dòng)脈插管,連接壓力傳感器通過BL-420E智能型生物信號(hào)處理系統(tǒng)監(jiān)測平均動(dòng)脈壓(MAP),股靜脈插管,微量泵輸注乳酸林格液1ml·kg-1·h-1。腹部正中脫毛,正中切口進(jìn)腹,分離腸系膜上動(dòng)脈,A組只分離腸系膜上動(dòng)脈,不阻斷,B、C、D三組用無損傷動(dòng)脈夾夾閉腸系膜上動(dòng)脈根部,45min后松開動(dòng)脈夾,進(jìn)行再灌注1h。C、D組在再灌注前15min分別腹腔給予色甘酸鈉50mg/kg、25mg/kg,A、B組分別給予等量的生理鹽水。1.3常規(guī)切片制作立即分離、摘取雙側(cè)肺臟,留取左上肺葉,立刻放入液氮中冷凍,制備成組織勻漿。右肺上葉用于含水率的測定,右肺中葉用10%甲醛固定,制作常規(guī)石蠟切片。右肺下葉則行支氣管肺泡灌洗,從氣管注入2ml生理鹽水,反復(fù)3次,得支氣管肺泡灌洗液(BALF),離心3000g×5min,取上清液-20℃保存待測。另在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)抽取下腔靜脈血2ml離心3000g×15min,取血清-20℃保存待測。1.4肺損傷程度HE染色,采用盲法,由病理科醫(yī)生在光鏡下觀察肺組織學(xué)改變。參照Hofbauer等的方法,根據(jù)肺實(shí)質(zhì)組織和空肺泡所占面積的百分比判斷肺損傷的程度。0分(正常):肺實(shí)質(zhì)組織面積<15%,空泡面積>85%;1分:肺實(shí)質(zhì)組織面積15%~25%,空泡面積75%~85%;2分:肺實(shí)質(zhì)組織面積25%~50%,空泡面積50%~75%;3分:肺實(shí)質(zhì)組織面積50%~75%,空泡面積25%~50%;4分:肺實(shí)質(zhì)組織面積75%~100%,空泡面積0~25%。1.5試劑盒的制備采用肺組織免疫組化SP染色法觀察肥大細(xì)胞類胰蛋白酶表達(dá)。具體步驟為:石蠟切片脫蠟至水后蒸餾水清洗,用pH9.0EDTA高壓修復(fù)2min后自然冷卻,蒸餾水清洗后,3%雙氧水浸泡10min后再用蒸餾水清洗,PBS清洗5min×3次,加一抗37℃水浴1h,再用PBS清洗5min×3次,加二抗37℃水浴30min,PBS清洗5min×3次,1∶1∶1DAB顯色,蘇木素復(fù)染2min,0.1%鹽酸酒精分化,用水沖洗10min后用95%酒精脫水;烤箱烤干后中性樹膠封片。試劑盒購自福州邁新生物工程有限公司。以胞漿顯棕黃色為陽性細(xì)胞,于每張切片中用400倍光鏡隨機(jī)選取5個(gè)肺組織部位進(jìn)行觀察。1.6肺含水率測定取右肺上葉組織,準(zhǔn)確稱重(濕重)后于85℃干燥箱(876-1型真空干燥箱,南通科學(xué)儀器廠)烘烤24h后再稱重(干重),肺含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。1.7肺滲透性指數(shù)的測定采用試管法測定BALF與血清中蛋白濃度之比(上海申能博彩生物科技有限公司),即為肺通透性指數(shù)。1.8肺組織的mda含量和sod活性的測定組織勻漿采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測定MDA含量,采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性。1.9肺組織勻漿酰胺濃度測定—肺組織組胺濃度的測定取肺組織勻漿,用試管法測定組織總蛋白濃度,采用大鼠酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定肺組織勻漿組胺濃度,肺組織組胺濃度根據(jù)組胺量/總蛋白量計(jì)算而得。1.10lsd-t檢驗(yàn)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間比較采用方差分析LSD-t檢驗(yàn)法,并采用Pearson相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1肺間隔及肺間隔增注c組光鏡下A組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常,B組可見肺間隔增厚,間質(zhì)水腫,中性粒細(xì)胞浸潤增多,并有中度肺出血;C組可見肺間隔稍增厚,有少量出血及纖維蛋白滲出物;D組肺間隔增厚不明顯,亦有少量出血及中性粒細(xì)胞浸潤(見圖1)。肺損傷病理評分顯示B組最高,A組最低,C組低于D組(P<0.01),(見表1)2.2肺組織的肥大組織特征B組在數(shù)值上高于其他三組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),(見表1,圖2)。2.3組大鼠血清中b組和b組的比較與A組比較,B組及D組肺含水率顯著性升高(P<0.05);與B組比較,C組明顯下降(P<0.05);C、D兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),(見表1)。2.4肺滲透性指數(shù)的變化四組中,B組最高(P<0.05),其余三組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),(見表1)。2.5兩組c、d比差異A組最低,B肺組織MDA含量最高(P<0.05);C、D兩組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),(見表1)。四組中,MDA含量與肺損傷評分呈正相關(guān),r=0.721,P<0.001。2.6兩組c、d比差異A組最高,B肺組織SOD活性最低(P<0.05);C、D兩組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),(見表1)。四組中,SOD活性與肺損傷評分呈負(fù)相關(guān),r=-0.724,P<0.001。2.7肺組織中胺含量的變化四組之間肺組織組胺含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),(見表1)。3色甘酸鈉對肺損傷的作用機(jī)制腸缺血/再灌注損傷是臨床上常見的問題,如小腸移植、腸系膜動(dòng)脈栓塞等,氧自由基損傷可能為腸缺血/再灌注致遠(yuǎn)隔器官損傷的重要病理機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)模型組腸缺血/再灌注后肺組織MDA含量增加、SOD活性明顯下降,且肺含水率及肺通透性指數(shù)均明顯增加,光鏡下發(fā)現(xiàn)模型肺組織出現(xiàn)間質(zhì)水腫、中性粒細(xì)胞浸潤增加和出血等病理改變,肺損傷病理評分明顯升高,相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)肺組織MDA含量和SOD活性與肺損傷病理評分存在明顯的相關(guān)性,以上研究結(jié)果表明氧自由基在腸缺血/再灌注致肺損傷過程中起著重要的作用。肺內(nèi)肥大細(xì)胞選擇性位于肺外周(如支氣管腔和上皮組織內(nèi))、肺血管周圍、支氣管周圍和內(nèi)壁、平滑肌及粘液腺內(nèi),是神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的一種關(guān)鍵細(xì)胞,參與機(jī)體多種生理和病理功能的調(diào)節(jié)。急性炎癥時(shí),一系列細(xì)胞因子通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)使肥大細(xì)胞數(shù)量急劇增加,并激活肥大細(xì)胞,促使其脫顆粒,釋放大量的炎性介質(zhì)、酶以及細(xì)胞因子等活性成分,如組胺、前列腺素D2以及白三烯、白介素、TNF-α等炎性細(xì)胞因子,加重器官的損害。本研究發(fā)現(xiàn)腸缺血/再灌注后肺內(nèi)肥大細(xì)胞雖有數(shù)量上的增加,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與Kasacka等研究結(jié)果不同,肺組織的組胺濃度變化也不大,組胺是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì),Akerstrom通過抗組胺預(yù)處理,可以減少白蛋白滲出,減少中性粒細(xì)胞聚集等,減輕了組織損害程度。本研究結(jié)果可能與再灌注時(shí)間僅為1h有關(guān),需進(jìn)一步研究。色甘酸鈉是一種抗變態(tài)反應(yīng)藥物,其作用機(jī)制是能穩(wěn)定肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜,阻止肥大細(xì)胞脫穎粒,從而抑制組胺、TNF-α、慢反應(yīng)物質(zhì)的釋放。Vural等在肺缺血/再灌注損傷過程中發(fā)現(xiàn),使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑色甘酸鈉能夠減少肺組織炎癥損傷,為色甘酸鈉在治療器官缺血/再灌注損傷提供了有力的證據(jù)。色甘酸鈉不僅能夠抑制嗜酸性粒細(xì)胞釋放超氧化物,而且還能抑制超氧化物陰離子及NADPH氧化酶的合成,從而減少氧自由基的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)使用色甘酸鈉后肺組織MDA含量下降、SOD活性升高,肺損傷病理評分下降,表明肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑色甘酸鈉能一定程度地減少