電針及其預(yù)處理對cums大鼠海馬5-h、5-h表達(dá)的影響

電針及其預(yù)處理對cums大鼠海馬5-h、5-h表達(dá)的影響

抑郁具有“四病多快”的特點(diǎn)，如高發(fā)病率、高自殺、高復(fù)發(fā)、高殘疾、識別率、治療率和綜合控制率。與嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題和突出的社會問題相比，國際社會達(dá)成了共識。世界衛(wèi)生組織(WHO)將21世紀(jì)的第一年(2001年)定為“精神衛(wèi)生年”,21世紀(jì)也被稱為“抑郁癥的世紀(jì)”,預(yù)計(jì)到2020年,抑郁癥將會排到“全球疾病負(fù)擔(dān)”的第二位。長期研究證實(shí),抑郁癥與5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)系統(tǒng)功能低下密切相關(guān)(經(jīng)典單胺假說),其紊亂將導(dǎo)致一系列不良情緒產(chǎn)生,如焦慮、抑郁、恐懼等。5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTT)是5-HT能神經(jīng)末梢的一種膜蛋白,能和突觸間隙中5-HT結(jié)合,將其轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元的軸突末端,因此決定了突觸后受體介導(dǎo)信號的強(qiáng)度和作用持續(xù)時(shí)間,成為反映5-HT能神經(jīng)元功能活動的重要指標(biāo),也是5-HT能神經(jīng)末梢多寡的間接反映,其表達(dá)變化直接影響5-HT參與的神經(jīng)活動。為此本研究擬通過孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(chronicunpredictablemildstress,CUMS)復(fù)制抑郁癥模型并運(yùn)用電針進(jìn)行干預(yù),通過免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬內(nèi)5-HT及5-HTT的表達(dá)情況,以探索5-HT、5-HTT在大鼠實(shí)驗(yàn)性抑郁癥發(fā)病過程中的作用機(jī)制及電針干預(yù)對其的影響,為臨床抑郁癥的診斷和防治提供新的途徑及實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1[國家標(biāo)準(zhǔn)]scxk成年雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±10)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[合格證號:SCXK(京)2006-0009]。1.1.2實(shí)驗(yàn)大鼠行為評分飼養(yǎng)條件如下:溫度(25±2)℃,濕度(50±20)%,自然光照,自由進(jìn)食、進(jìn)水(除實(shí)驗(yàn)要求禁食禁水外)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,1周后采用開野試驗(yàn)、糖水試驗(yàn)及體重測量進(jìn)行行為學(xué)評分,選取得分相近的SD大鼠60只,隨機(jī)分為5組,每組12只?？瞻捉M6只/籠飼養(yǎng),正常飲食,不給予任何刺激;模型組1只/籠孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激。1.1.3羊抗兔免疫干擾試驗(yàn)(1)試劑耗材:百憂解(美國禮來公司生產(chǎn),20mg×7,批號:J20030017);5-HT、5-HTT抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG及SP試劑盒(北京中山生物科技公司);DAB顯色試劑盒(北京中山生物科技公司);枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);PBS緩沖液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。(2)針具:華佗牌無菌針灸針,規(guī)格:0.30mm×25mm(天津杏林書院醫(yī)療器械有限公司);LH202型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所監(jiān)制,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司生產(chǎn));ZJ-12H音樂電針治療儀(中國針灸學(xué)會研制,哈爾濱致厚醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。1.2方法1.2.1單因素繁殖和cums模型的建立1.2.2“百會”針、“印堂”針空白組:不給予任何處理。模型組:每天給予慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)。脈沖電針組:每天給予慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng),參照全國針灸學(xué)會實(shí)驗(yàn)針灸研究會制定的“實(shí)驗(yàn)動物針灸穴位圖譜”選取相當(dāng)于人體解剖部位的“百會”穴和“印堂”穴進(jìn)行針刺,針柄接韓氏電針儀,于每日進(jìn)行應(yīng)激刺激前1h進(jìn)行電針,平刺進(jìn)針,“百會”針尖向后頭部,“印堂”針尖向鼻尖方向(兩針柄間放置消毒脫脂棉球隔離以避免短路),進(jìn)針深度為0.5~1cm,電針頻率為2Hz,電流強(qiáng)度為1mA,每次20min,每天1次,共電針21天。電針預(yù)處理組:在實(shí)驗(yàn)開始前10天進(jìn)行和電針組同樣的針刺,但不予造模刺激,而是等到第11天開始,和所有需要造模的大鼠一起接受造模刺激,并繼續(xù)接受電針治療,共電針31天。百憂解組:每天給予慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng),將百憂解以生理鹽水配制成1mg/ml,按照2mg/kg灌胃給藥,每天1次,共21天。1.2.3內(nèi)側(cè)周壁及眼底分布敞箱長100cm×寬100cm×高50cm,內(nèi)側(cè)周壁及底面均為黑色,底面用白線劃分為面積相等的25塊。操作步驟參考本課題組前期研究結(jié)果,但將觀察時(shí)間由3min延長至5min。1.2.4抗抗體濃度5-ht、5-htt表達(dá)情況免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬5-HT、5-HTT表達(dá)情況,具體操作步驟參考本課題組前期研究結(jié)果,一抗抗體濃度5-HT(1:50)、5-HTT(1:50)。1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1造模成功組和驗(yàn)證如封三彩圖1所示,應(yīng)激刺激21天后模型組水平運(yùn)動及垂直運(yùn)動與空白組比較均明顯減少(P<0.01),說明造模成功。與模型組比較,百憂解組與兩個(gè)電針組活動度均明顯升高(P<0.01),說明百憂解和兩種電針均有抗抑郁作用,且兩組電針與百憂解組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2.2各組小鼠海馬內(nèi)5-ht表達(dá)比較如封三彩圖2所示,模型組大鼠海馬內(nèi)5-HT、5-HTT表達(dá)水平下降,與空白組比較有顯著性差異(P<0.01);脈沖電針組、電針預(yù)處理組及百憂解組與模型組比較,海馬內(nèi)5-HT表達(dá)上調(diào),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),而3組治療組之間無差異;脈沖電針組、百憂解組與模型組比較,海馬內(nèi)5-HTT表達(dá)上調(diào)(P<0.01),電針預(yù)處理組與模型組比較,有上調(diào)趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,脈沖電針組、百憂解組與電針預(yù)處理組比較,有顯著性差異(P<0.01),說明電針預(yù)處理上調(diào)5-HTT效果不及其余兩治療組。3促進(jìn)5-ht神經(jīng)通信通量的改變本實(shí)驗(yàn)采用孤養(yǎng)與CUMS結(jié)合的方法復(fù)制抑郁模型,具有應(yīng)激因子多變及不可預(yù)見的特點(diǎn),與人類抑郁癥的發(fā)病機(jī)制比較相似。造模后模型組大鼠活動減少,探索興趣降低,說明抑郁模型復(fù)制成功,藥物組和電針組均能逆轉(zhuǎn)此變化,有抗抑郁的作用,可進(jìn)行下一步機(jī)制分析。海馬與學(xué)習(xí)、記憶、行為及情緒密切相關(guān),是應(yīng)激損傷的重要靶點(diǎn)。五羥色胺(5-HT,serotonin)是動物體內(nèi)一種高度保守的化學(xué)物質(zhì),存在于大腦和消化道中,具有傳導(dǎo)神經(jīng)信號的功能,在各種調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵性的作用,如情感、動機(jī)、認(rèn)知、喂食、睡眠及傷害性感受等等。5-HT在發(fā)揮生理功能后被滅活,以免產(chǎn)生中毒反應(yīng)及5-HT受體的脫敏,這個(gè)過程主要是依靠5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體來完成的。五羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(5-HTtransporter,5-HTT/serotonintransporter,SERT)是一種對5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,廣泛存在于大腦的邊緣系統(tǒng)、胃腸道的嗜鉻細(xì)胞膜、肥大細(xì)胞及5-HT能神經(jīng)突觸前膜上。它從神經(jīng)突觸間隙中重新攝取5-HT進(jìn)入突觸前神經(jīng)元,可以直接影響突觸間隙5-HT的濃度,并能間接反映5-HT能神經(jīng)纖維末梢的數(shù)量。5-HTT從突觸間隙中移除5-HT而決定突觸后受體介導(dǎo)信號的量和作用的持續(xù)時(shí)間,進(jìn)而在5-HT神經(jīng)傳遞的微調(diào)中起著關(guān)鍵的作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為抑郁癥發(fā)病的病機(jī)是臟氣受損、髓海虧虛、神機(jī)紊亂。印堂、百會為督脈之穴,督脈行于身后,循脊入腦,其布在身,其用在神,其本在腦,本著“經(jīng)脈所過,主治所及”,選取督脈治療與腦相關(guān)的神志病符合中醫(yī)治病必求其本之說。此外,印堂穴具有調(diào)神醒腦之功效,百會穴為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰肝經(jīng)之會,選取印堂、百會來治療抑郁癥,可以調(diào)節(jié)其髓海機(jī)能,增進(jìn)其“五臟化氣”的生理功能,使其紊亂的神機(jī)恢復(fù)正常,以達(dá)到抗抑郁的效果。電針療法是在我國傳統(tǒng)針灸治療基礎(chǔ)上發(fā)展而來,脈沖電針儀能發(fā)出周期性重復(fù)的波形,用以加強(qiáng)針感,具有針刺和電場的雙重作用。近10年來國內(nèi)外研究表明針灸預(yù)處理能啟動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制,調(diào)動各種自我反饋和調(diào)節(jié)機(jī)制以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,產(chǎn)生預(yù)防疾病的作用。趙宇輝通過研究發(fā)現(xiàn)針灸預(yù)處理可以延緩或者阻斷試驗(yàn)性心肌缺血的發(fā)展進(jìn)程,并且具有提高心肌組織在缺血時(shí)對一系列代謝紊亂的耐受能力,增加心肌細(xì)胞的存活率,改善預(yù)后的作用。有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),針刺預(yù)處理與造模間隔時(shí)間長短不同對于神經(jīng)元的保護(hù)作用有很大差異,預(yù)處理后半小時(shí)再進(jìn)行腦出血造?？墒谷X缺血再灌注后變形死亡的神經(jīng)元減少25~30%。路志紅等在大鼠進(jìn)行腦缺血造模前對百會穴進(jìn)行針灸預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)針灸預(yù)處理后的大鼠可明顯縮小腦缺血造模引起腦及神經(jīng)的損害程度,與肢體非穴相比,其誘導(dǎo)大鼠腦缺血耐受的作用具有明顯的差異。由于針刺預(yù)處理更為安全可行,因此更具有臨床研究與應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,脈沖電針與電針預(yù)處理治療在改善抑郁模型大鼠行為學(xué)方面與經(jīng)典藥物百憂解(即氟西汀)療效一致,說明電針及其預(yù)處理療法效果不遜于經(jīng)典抗抑郁藥物;抑郁大鼠海馬內(nèi)5-HT、5-HTT表達(dá)減少,兩組電針及百憂解均能上調(diào)其表達(dá),且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,只是在上調(diào)5-HTT方面,電針及百憂解較電針預(yù)處理療效略勝一籌。5-HTT是許多抗抑郁藥