二維核磁共振譜

二維核磁共振譜二維核磁共振的概述1．什么是二維譜二維核磁共振(2DNMR)方法是有Jeener

于1971年首先提出的,是一維譜衍生出來的新實(shí)驗(yàn)方法。引入二維后，減少了譜線的擁擠和重疊，提高了核之間相互關(guān)系的新信息。因而增加了結(jié)構(gòu)信息，有利于復(fù)雜譜圖的解析。特別是應(yīng)用于復(fù)雜的天然產(chǎn)物和生物大分子的結(jié)構(gòu)鑒定，2DNMR是目前適用于研究溶液中生物大分子構(gòu)象的唯一技術(shù)。一維譜的信號是一個頻率的函數(shù)，記為S(ω)，共振峰分別在一條頻率軸上。而二維譜是兩個獨(dú)立頻率變量的信號函數(shù)，記為S(ω1，ω2)，共振峰分布在由兩個頻率軸組成的平面上。2D-NMR的最大特點(diǎn)是將化學(xué)位移、偶合常數(shù)等參數(shù)在二維平面上展開，于是在一般一維譜中重疊在一個頻率軸上的信號，被分散到兩個獨(dú)立的頻率軸構(gòu)成的二維平面上，同時檢測出共振核之間的相互作用.2二維譜實(shí)驗(yàn)A.原則上二維譜可以用概念上不同的三種實(shí)驗(yàn)獲得：(1).頻率域?qū)嶒?yàn)(frequency-frequency)(2).混合時域(frequency-time)實(shí)驗(yàn)(3).時域(time-time)實(shí)驗(yàn).它是獲得二維譜的主要方法,以兩個獨(dú)立的時間變量進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn),得到S(t1,t2),經(jīng)過兩次傅立葉變換得到二維譜S(ω1,ω2).通常所指的2D-NMR均是時間域二維實(shí)驗(yàn)

B)二維核磁共振時間分割二維譜實(shí)驗(yàn)中，為確定所需的兩個獨(dú)立的時間變量，要用特種技術(shù)－時間分割。即把整個時間按其物理意義分割成四個區(qū)間。（如圖所示）（1）預(yù)備期：預(yù)備期在時間軸上通常是一個較長的時期，使核自旋體系回復(fù)對平衡狀態(tài)，在預(yù)備期末加一個或多個射頻脈沖，以產(chǎn)生所需要的單量子或多量子相干。（2）發(fā)展期：在t1開始時由一個脈沖或幾個脈沖使體系激發(fā)，此時間系控制磁化強(qiáng)度運(yùn)動，并根據(jù)各種不同的化學(xué)環(huán)境的不同進(jìn)動頻率對它們的橫向磁化矢量作出標(biāo)識。（3）混合期：在此期間通過相干或極化的傳遞，建立檢測條件。（4）檢測期：在此期間檢測作為t2函數(shù)的各種橫向矢量的FID的變化以及它的初始相及幅度受到t1函數(shù)的調(diào)制。C.實(shí)驗(yàn)過程：用固定時間增量⊿t1依次遞增t1進(jìn)行系列實(shí)驗(yàn)，反復(fù)疊加，因t2時間檢測的信號S(t2)的振幅或相位受到s(t1)的調(diào)制，則接收的信號不僅與t2有關(guān)，還與t1有關(guān)，每改變一個t1，記錄S(t2),因此得到分別以時間變量t1,t2為行列排列數(shù)據(jù)矩陣，即在檢測期獲得一組FID信號，組成二維時間信號S(t1,t2)。因t1,t2是兩個獨(dú)立時間變量，可以分別對它們進(jìn)行傅立葉變換，一次對t2,一次對t1,兩次傅立葉變換的結(jié)果，可以得到兩個頻率變量函數(shù)S(ω1,ω2)。如圖3．二維譜的表達(dá)方式（1）堆積圖(stackedplot).堆積圖的優(yōu)點(diǎn)是直觀,具有立體感.缺點(diǎn)是難以確定吸收峰的頻率。大峰后面可能隱藏小峰，而且耗時較長。(2)等高線（Contourplot）

等高線圖類似于等高線地圖，這種圖的優(yōu)點(diǎn)是容易獲得頻率定量數(shù)據(jù)，作圖快。缺點(diǎn)是低強(qiáng)度的峰可能漏畫。目前化學(xué)位移相關(guān)譜廣泛采用等高線。圖4.3堆積圖等高線4．二維譜峰的命名（1）交叉峰（crosspeak）:出現(xiàn)在ω1≠ω2處，（即非對角線上）。從峰的位置關(guān)系可以判斷哪些峰之間有偶合關(guān)系，從而得到哪些核之間有偶合關(guān)系，交叉峰是二維譜中最有用的部分。（2）對角峰（Autopeak）:位于對角線（ω1＝ω2）上的峰，稱為對角峰。對角峰在F1和F2軸的投影。5．二維譜的分類二維譜可分為三類：1）J分辨譜（Jresolvedspectroscopy）

J分辨譜亦稱J譜或者δ-J譜。它把化學(xué)位移和自旋偶合的作用分辨開來，包括異核和同核J譜。2）化學(xué)位移相關(guān)譜(chemicalshiftcorrelationspectroscopy)

化學(xué)位移相關(guān)譜也稱δ-δ譜，是二維譜的核心，通常所指的二維譜就是化學(xué)位移相關(guān)譜。包括同核化學(xué)位移相關(guān)譜，異核化學(xué)位移相關(guān)譜，NOESY和化學(xué)交換。3）多量子譜（multiplequantumspectroscopy）用脈沖序列可以檢測出多量子躍遷，得到多量子二維譜。化學(xué)位移相關(guān)譜（CorrelatedSpectroscopy,COSY）

二維化學(xué)位移相關(guān)譜包括同核化學(xué)位移相關(guān)譜（Homonuclearcorrelation）1）通過化學(xué)鍵：COSY,TOCSY,2D-INADEQUATE。2）通過空間：NOESY,ROESY。異核化學(xué)位移相關(guān)譜(Heteronuclearcorrelation）強(qiáng)調(diào)大的偶合常數(shù)：1H-13C–COSY強(qiáng)調(diào)小的偶合常數(shù)，壓制大的偶合常數(shù)：COLOC(遠(yuǎn)程1H-13C–COSY)

同核化學(xué)位移相關(guān)譜一、COSY(Correlatedspectroscopy)

所謂的COSY指同一自旋體系里質(zhì)子之間的偶合相關(guān)。1H-1H-COSY可以1H-1H之間通過成鍵作用的相關(guān)信息，類似于一維譜同核去偶，可提供全部1H-1H之間的關(guān)聯(lián)。因此1H-1H-COSY是歸屬譜線，推導(dǎo)結(jié)構(gòu)及確定結(jié)構(gòu)的有力工具。1、COSY－90。的基本脈沖序列包括兩個基本脈沖。在此脈沖作用下，根據(jù)發(fā)展期t1的不同，自旋體系的各個不同的躍遷之間產(chǎn)生磁化傳遞，通過同核偶合建立同種核共振頻率間連接圖。此圖的二個軸都是1H的δ在ω1＝ω2的對角線上可以找出一維1H譜相對應(yīng)譜峰信號。通過交叉峰分別作垂線及水平線與對角線相交，即可以找到相應(yīng)偶合的氫核。因此從一張同核位移相關(guān)譜可找出所有偶合體系，即等于一整套雙照射實(shí)驗(yàn)的譜圖。

COSYof2－丁烯酸乙酯三。NOESY（NuclearOverhauserEffectSpectroscopy)核間磁化傳遞是通過非相干作用傳遞，這種傳遞是靠交叉馳豫和化學(xué)交換來進(jìn)行。即樣品間偶極－偶極傳遞的。NOESY的基本序列在COSY序列的基礎(chǔ)上，加一個固定延遲和第三脈沖，以檢測NOE和化學(xué)交換的信息。混合時間tm是NOESY實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵參數(shù)，tm的選擇對檢測化學(xué)交換或NOESY效果有很大影響。選擇合適的tm,可在最后一個脈沖，產(chǎn)生最大的交換，或建立最大的NOE.NOESY的譜圖特征類似于COSY譜，一維譜中出現(xiàn)出現(xiàn)NOE的兩個核在二維譜顯示交叉峰。NOESY可以在一張譜圖上描繪出分子之間的空間關(guān)系。Codeine的NOESY6,7359101211Codeine在高場放大的NOESY13’131818’161717’11148-7,12

7-18,18'

3-5,10

5-11,16,18'

9-10,17,17'

10-16

11-18,16,14,18'

18-13,18'

16-14,17

13-14,17,17'

13'-17,17'

17-17‘TableofNOEs

TOCSY

TOCSY脈沖序列：是一種旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系實(shí)驗(yàn)（自旋鎖定實(shí)驗(yàn)），自旋鎖定是把COSY序列中的第二脈沖以及NOESY序列中最后兩個脈沖（包括混合時間），用一個長射頻脈沖取代，把自旋沿著旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系的一個鎖定，在這種情況下不存在化學(xué)位移差，通過發(fā)生標(biāo)量偶合的磁化轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致了全部相關(guān)。質(zhì)子a、b、c、d構(gòu)成自旋體系既一個偶合系統(tǒng)，CH3CH2構(gòu)成另外一個偶合系統(tǒng)。這是兩個獨(dú)立的自旋體系，COSY：CH2a與CH2b相關(guān)。而TOCSY：它不僅顯示a與質(zhì)子b相關(guān)，而且也與兩個(CH2)

c、d相關(guān)。

TOCSYofcodeineCOSYTOCSY391012111816,13,14,13’183,163,53,163,953-103,103,5

TableofTOCSYpeaks:

('indicatesthemoreupfieldofgeminalCH2protons)8-->7

3-->5,9,10,16

5-->9,10,b11,16

9-->10,16,OH,H2O

10-->16,OH,H2O

11-->16,18,18'

18-->16,18'

16-->18'

13-->13',17,17'

13'-->17,17'

17-->17'ROESY若采用一個弱自旋鎖場，則在旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)體系中產(chǎn)生交叉馳豫NOE,得到ROESY譜（RotatingNOE),即旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系中的NOE增強(qiáng)譜。它類似于NOESY，能提供空間距離相近的核的相關(guān)信息。它的基本序列與TOCSY相似，但采用低功率自旋鎖場，可由連續(xù)波照射或一系列小脈沖角脈沖組成混合脈沖。ROESY與NOESY區(qū)別：NOESY在分子量大和小的分子體系中，靈敏度很高。小分子的快速運(yùn)動，產(chǎn)生NOE,大分子的或降溫產(chǎn)生負(fù)NOE.而中等分子（300～1500）或特殊形狀分子，在NOESY中得不到交叉峰。而ROESY交叉峰與分子量的大小無關(guān)。由于ROESY是低的功率實(shí)驗(yàn)，可以檢測到小的相互作用。異核化學(xué)位移相關(guān)譜-HeteronuclearCorrelationofchemicalshift

所謂異核化學(xué)位移相關(guān)譜是兩個不同核的頻率通過標(biāo)量偶合建立起來的相關(guān)譜.應(yīng)用最廣泛的是1H-13CCOSY.

常規(guī)的1H-13CCOSY是指直接相連的C-H之間的偶合相關(guān)（1JCH）。1H-13C-COSY譜圖中F2為13C化學(xué)位移，F(xiàn)1為1H化學(xué)位移，沒有對角峰，其交叉峰表明C-H偶合的信息。解析時，可以從一已知的氫核信號，根據(jù)相關(guān)關(guān)系，即可找到與之相連的13C信號，反之亦然。可以從譜圖中得到1JC-H的結(jié)構(gòu)信息。13C-1HCOSY2-丁烯酸乙酯ADCB7.78.157.47.5111.6120.6122.6127COLOC(CorrelationSpectroscopyvialongrangecoupling)和1H-13C-COSY序列基本一樣，只是在COLOC譜中對應(yīng)于遠(yuǎn)程C-H偶合常數(shù)nJ(2JCH,3JCH)，而不是1JCH。得到一鍵以上的CH偶合相關(guān)信息，建立C-C之間的關(guān)聯(lián)，可以躍過N,O等其它官能團(tuán)。成為推導(dǎo)結(jié)構(gòu)歸屬信號，解決由于屏蔽效應(yīng)難以解決的季碳?xì)w屬的有力工具。由于該方法能夠?qū)⒓咎己拖噜徧嫉馁|(zhì)子相關(guān)，對于確定C-C連接非常有效。常規(guī)的1H-13C-COSY沒有季碳和其它質(zhì)子的相關(guān)峰。COLOC譜圖類似于C-H-COSY,兩個坐標(biāo)（F1,F2)是化學(xué)位移，交叉峰也類似于C-H-COSY，只是出現(xiàn)了小偶合的相關(guān)峰。COLOC最大的缺點(diǎn)是相關(guān)峰中包含所有的1JCH信號。解析譜圖時一定要對照C-H-COSY。確定1JCH,分辨出2JCH,3JCH.多量子躍遷譜常見的核磁是選擇的單量子躍遷。在偶極相互作用及其影響下，自旋體系的能級不再由單一態(tài)波函數(shù)，而變成混合態(tài)，可能出現(xiàn)多量子躍遷。產(chǎn)生的多量子躍遷不能直接觀察到，要把它變回可觀察的單量子躍遷才能進(jìn)行檢測，得到S(t1,t2)后經(jīng)過傅立葉變換得到頻率譜。常見的多量子躍遷譜有HMQC、HMBC。與1H-13CCOSY、COLOC譜相似。由于多量子相干轉(zhuǎn)移，使其靈敏度大大提高。對于測定時間相等的條件下所需的樣品量為：

1H-13CCOSY5~10mg(20mM)COLOC5~10mg(20mM)HMQC1mg(5mM)HMBC2~3mg(7mM)因此這兩種方法為分子量大的微量樣品的測定提供了廣闊的前景。HMQC

(1-bondCHcorrelation)

1H檢測的異核多量子相干譜HMQC是將1H信號的振幅及相位分別依13C化學(xué)位移及1H間的同核化學(xué)偶合信息調(diào)制，并通過直接檢測調(diào)制后的1H信號，獲得13C-1H化學(xué)位移相關(guān)數(shù)據(jù)。它所提供的信息及譜圖與1H-13CCOSY完全相同。及圖上的兩個坐標(biāo)分別是1H,13C化學(xué)位移，直接相連的13C與1H將在對應(yīng)的13C化學(xué)位移與1H化學(xué)位移的交點(diǎn)處給出相關(guān)信號。不能得到季碳的結(jié)構(gòu)信息。HMQCofCodeine13CAssignment6.611386.512075.713335.312854.89194.266103.856123.359113.0&2.320182.640162.6&2.446132.443142.0&1.83617HSQC-DEPT這個實(shí)驗(yàn)有一個變化，顯示CH2與CH、CH3有不同的相位。CH2顯示負(fù)的相位，在下圖中用紅色表示。在Codeine中的三個CH2很容易辨認(rèn)。這種技術(shù)稱之為HSQC-DEPTspectrum.

HSQC-DEPTofCodeineHMBC

(multiple-bondCHcorrelation)HMBC是一種測定遠(yuǎn)程1H-13C相關(guān)的十分靈敏的方法，它給出遠(yuǎn)程1H-13C相關(guān)信息。特別是適用于檢測與甲基有遠(yuǎn)程偶合的碳（2JCH,3JCH).其基本原理是：通過1H檢測異核多量子相干調(diào)制，選擇性地增加某些碳信號的靈敏度，是孤立的自旋體系相關(guān)聯(lián)，而組成一個整體分子。對于質(zhì)子相隔兩個、三個鍵(2JCH,3JCH)的碳，提供了有效的相關(guān)信息，抑制了直接偶合的1JCH信號強(qiáng)度使譜圖簡化。該法適用于具有眾多甲基地天然產(chǎn)物，如三萜化合物，甾醇化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。HMBC可高靈敏度地檢測13C-1H遠(yuǎn)程偶合(2JCH,3JCH)，因此可得到有關(guān)季碳的結(jié)構(gòu)信息及其被雜原子切斷地1H偶合系統(tǒng)之間的結(jié)構(gòu)信息。利用二維核磁共振推導(dǎo)未知化合物的結(jié)構(gòu)1、確定化合物的分子式，計算不飽和度。2、官能團(tuán)推導(dǎo)。3、氫譜與碳譜信號的指認(rèn)4、結(jié)構(gòu)片斷的推導(dǎo)5、結(jié)構(gòu)片斷的連接6、立體化學(xué)的確定7、歸屬化合物的信號驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。例1。下面未知化合物的分子式是C25H28O5，根據(jù)下面的核磁譜圖推導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)DEPT2.56~2.602.301.461.79~1.897.316.86COSYHMQC94.5(6)103.1(4a)161.8(5)H-3196.878.7130.830.4(C-2”)46.5(C1”)107.0(c-8)148.3(C8”)160.6(8a)163..1(7)109HMBC1.確定化合物的分子式，計算不飽和度。該化合物分子式為C25H28O5，不飽和度為12。2.

H、CNMR的信號進(jìn)行指認(rèn)DEPT顯示化合物中有2個甲基，6CH2、5CH、10C.2個Me(1.59,22.5)(1.61,19.0)4。結(jié)構(gòu)片斷3.考慮分子的對稱性有2個對稱碳δ5.29(dd,J=13.2,2.9HZ,H2),3.03(dd,J=17.2,2.9,H-3),2.77(dd,17.2,13.2H-3)是典型黃酮。12.99羥基表明是5－羥基黃酮。碳譜中還有11個sp2雜化碳進(jìn)一步證明是黃酮結(jié)構(gòu)。7.31（d,2H,J=8.8HZ)6.86(d,2H,J=8.8Hz),表明存在對位取代的苯基。10746。5148。330。4160。6163。1146。31。59，22。51。6119148。319146。222。55。分子片斷的連接94.5(6)103.1(4a)161.8(5)H-3196.878.7130.830.4(C-2”)46.5