蛋白質(zhì)工程PROTEINENGINEERING概述

7.1概述誕生于20世紀80年代初；1983年，美國加州基因公司Ulmer在SCIENCE(VOL.219)上發(fā)表以“ProteinEngineering”為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標志.2000年6月26日，人類基因組的工作草圖宣告完成，標志著生命科學迎來了后基因組時代（post-genomeera）。1蛋白質(zhì)工程通過對蛋白質(zhì)已知結(jié)構(gòu)和功能的了解，借助計算機輔助設(shè)計，利用基因定位誘變等技術(shù)，特異性地對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因進行改造，產(chǎn)生具有新的特性的蛋白質(zhì)的技術(shù)，并由此深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,并使蛋白質(zhì)更好地造福于人類。——蛋白質(zhì)工程：側(cè)重于對現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造——酶工程：側(cè)重于對現(xiàn)有蛋白質(zhì)的合理利用2基本步驟分離純化目的蛋白氨基酸測序、X－射線衍射分析、NMR等測試，目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的分析目的基因的獲得及預(yù)測改造基因序列（定點突變等）改造后的基因序列進行表達分離純化表達產(chǎn)物，檢測這個步驟實際上是對現(xiàn)有蛋白的改造。3蛋白質(zhì)工程的方向

基因水平上的蛋白質(zhì)改造：即在基因水平上改變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)和功能；DNA合成技術(shù)用于蛋白質(zhì)功能片段多肽基因的合成，可創(chuàng)造結(jié)構(gòu)和功能全新的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)水平上的修飾（即基因翻譯后的蛋白質(zhì)修飾）:對蛋白質(zhì)分子進行化學修飾和生物修飾，延長蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。4研究的核心內(nèi)容

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析（X－射線衍射、NMR）

高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分子設(shè)計蛋白質(zhì)的修飾與表達

57.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析6蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)有4個嚴格的層次，即蛋白質(zhì)的一級至四級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（primarystructure）是指多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序。線性多肽鏈在空間折疊成特定的三維空間結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)包括：二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)。7蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的四個層次一級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)87.3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定與預(yù)測肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖綠色熒光蛋白（GFP）/newsf/2008-10/2008109173851.htm9一級結(jié)構(gòu)測定基本方法：（1）應(yīng)用化學裂解法和蛋白酶水解法將多肽鏈專一性裂解；（2）逐一測定每個純化的小肽段的順序；（3）根據(jù)肽段氨基酸順序中的重疊區(qū)確定小肽段的排列次序；（4）完成整條多肽鏈的順序分析。盡管蛋白質(zhì)順序分析已經(jīng)自動化，但仍然耗時、復(fù)雜并且昂貴。重組DNA技術(shù)出現(xiàn)后，人們可以從cDNA或基因序列直接推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的氨基酸順序，速度快且經(jīng)濟，已成為最常用的測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的方法。107.3.1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測定11X射線晶體衍射法（X-raycrystallography）和中子衍射法測定晶體中的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象.核磁共振法（nuclearmagneticresonance，NMR）、園二色性光譜法、激光拉曼光譜法、熒光光譜法、紫外差光譜法和氫同位素交換法等測定溶液中的蛋白質(zhì)構(gòu)象。根據(jù)蛋白質(zhì)的狀態(tài)，測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法分為兩大類：aX射線晶體衍射法其研究方法是用X射線轟擊待分析的混合物的結(jié)晶，并用照相底片將其拍攝下來。這樣，就可以得到一張結(jié)晶分子的側(cè)視影象照片。通過各種角度的影象照片，就可以建立起一個該混合物分子結(jié)構(gòu)的三維影象。121957年Kendrew用這種方法給出第一張三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)——肌紅蛋白的0.6nm的真實圖像；1959年P(guān)erutz完成血紅蛋白0.55nm分辨率的晶體結(jié)構(gòu)；Kendrew（1917-1997），Perutz（1914-2002）。（1962年）13X－射線晶體衍射分析的缺點測定結(jié)果可靠，但需分離出足夠量的純蛋白質(zhì)(幾毫克-幾十毫克)，制備出單晶體，然后再進行繁雜的數(shù)據(jù)收集、計算和分析。而多數(shù)蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶。與溶液中的構(gòu)象相比，蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象是靜態(tài)的。所以，利用蛋白質(zhì)晶體不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象。蛋白質(zhì)的晶體狀態(tài)與自然狀態(tài)也不盡相同，在分析的時候要考慮到這個問題。工作流程較長。X－射線晶體衍射儀14b核磁共振（NMR）不過，最初科學家只能將這種方法用于分析小分子的結(jié)構(gòu)，因為生物大分子非常復(fù)雜，分析起來難度很大?？茖W家在1945年發(fā)現(xiàn)磁場中的原子核會吸收一定頻率的電磁波，這就是核磁共振現(xiàn)象。由于不同的原子核吸收不同的電磁波，因而通過測定和分析受測物質(zhì)對電磁波的吸收情況就可以判定它含有哪種原子，原子之間的距離多大，并據(jù)此分析出它的三維結(jié)構(gòu)。15瑞士蘇黎世瑞士聯(lián)邦技術(shù)學院的庫爾特·烏特里希教授:選擇生物大分子中的質(zhì)子(氫原子核)作為測量對象，連續(xù)測定所有相鄰的兩個質(zhì)子之間的距離和方位，這些數(shù)據(jù)經(jīng)計算機處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖。1983年庫特-烏特里希(KurtWuthrich)教授首次運用NMR法解析了胰高血糖素從左至右?guī)焯?烏特里希(64歲)、田中耕一(43歲)、約翰-B-芬恩(85歲)（2000年）16NMR法最大的優(yōu)點:可分析溶液中的肽鏈的三維結(jié)構(gòu)，進而可對活細胞中的蛋白質(zhì)進行分析，這意味著可以測得接近生理狀態(tài)下的樣品，也能測出如蛋白質(zhì)鏈中極易活動、改變部分的動態(tài)的結(jié)構(gòu)。這種方法繞過了結(jié)晶、X－射線衍射成像分析等難點，直接分析自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。177.3.2相關(guān)數(shù)據(jù)庫多維NMR是目前唯一能夠用于測定蛋白質(zhì)或核酸溶液三維結(jié)構(gòu)的方法，但受分子量的限制。目前，科學家已經(jīng)利用這一方法繪制出15-20%的已知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。/pdb/(美國)18蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)是國際上唯一的生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)檔案庫，由美國Brookhaven國家實驗室建立。PDB收集的數(shù)據(jù)主要來源于X光晶體衍射和核磁共振(NMR)的數(shù)據(jù)，經(jīng)過整理和確認后存檔而成。目前PDB數(shù)據(jù)庫的維護由結(jié)構(gòu)生物信息學研究合作組織(RCSB)負責。使用Rasmol等軟件可以在計算機上按PDB文件顯示生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。/pdb/home/home.do(美國)例如：1HUY(GFP)1920網(wǎng)址：/pdb(美國)21PDB數(shù)據(jù)庫中當前的數(shù)據(jù)總量PDBContentGrowth

/pdb/statistics/contentGrowthChart.do?content=total&seqid=10022常用的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址：/是UniversalProtein的英文縮寫，是信息最豐富、資源最廣的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。它由整合Swiss-Prot、TrEMBL和PIR-PSD三大數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)而成。237.3.3蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測尋找某種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，首先應(yīng)該查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB，即查詢是否已經(jīng)有人做過該蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)測定。HPDB或PDB中只存儲至今人們已知其空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，數(shù)量占生物體中存在的各種蛋白質(zhì)的很小部分。如果已經(jīng)擁有蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)序列，無論是由蛋白質(zhì)測序儀直接測定得到氨基酸序列，或是由基因序列通過遺傳密碼翻譯推測得到氨基酸序列，都可以利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件（服務(wù)）對該蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。每種預(yù)測方法都是根據(jù)特定的規(guī)則進行合理的預(yù)測，具有一定的可信度。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的預(yù)測

/prediction/prediction.asp24蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測25預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法同源建?！繕诵蛄信c模板序列比較，按照模板序列的空間結(jié)構(gòu)，經(jīng)過優(yōu)化，產(chǎn)生目標序列三維結(jié)構(gòu)；折疊識別——預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測折疊方式，參考其它蛋白的空間結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生目標序列三維結(jié)構(gòu)；從無到有——單個氨基酸形成二級結(jié)構(gòu)的傾向，加上各種作用力力場信息，直接產(chǎn)生目標序列三維結(jié)構(gòu)。同源建模方法目前被認為是最精確的方法。相似性大于50％時，結(jié)果比較可靠；30～50％之間，其結(jié)果需要參考其它蛋白的信息。相似性小于30％時，人們一般采用折疊識別方法。相似性更小時，從無到有法更有效。26同源建模法的步驟從待測蛋白質(zhì)序列出發(fā)，搜索蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（如PDB,SWISS-PROT等），得到許多相似序列（同源序列），選定其中一個（或幾個）作為待測蛋白質(zhì)序列的模板；待測蛋白質(zhì)序列與選定的模板進行再次比對，插入各種可能的空位使兩者的保守位置盡量對齊；建模：調(diào)整待測蛋白序列中主鏈各個原子的位置，產(chǎn)生與模板相同或相似的空間結(jié)構(gòu)——待測蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型；利用能量最小化原理，使待測蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團處于能量最小的位置。最后提供給用戶的是經(jīng)過如上四步（或重復(fù)其中某幾步）后得到的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。2728同源建模法預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)同源建模比較復(fù)雜，Swiss-Model可提供自動化的同源模建分析任務(wù)http://www.expasy.ch/swissmod/SM_TOPPAGE.html29本文本框中輸入蛋白質(zhì)序列輸入個人郵箱及郵件名稱點擊提交，即可。7.4蛋白質(zhì)工程的研究方法30按改動部位的多寡分為三類小改（特定殘基的替換）：通過定位突變或化學修飾完成；目前最常用中改（肽段或結(jié)構(gòu)域的替換）：對來源于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進行組裝拼接大改（從頭設(shè)計）：完全從頭設(shè)計蛋白質(zhì)（全新蛋白）31現(xiàn)有蛋白質(zhì)的改造步驟如下：1、分離純化需要改造的目的蛋白；2、對目的蛋白進行氨基酸序列分析、X射線晶體衍射分析、核磁共振分析等分析；3、獲取編碼目的蛋白的基因序列；4、設(shè)計改造方案；5、對基因序列進行改造（定點突變（M13、PCR法）等）；6、將改造的基因片段連入合適的載體表達；7、分離、純化表達產(chǎn)物并對其進行功能檢測。32第一個成功的GFP突變體GFP的首個重大改變是錢永健在1995年完成。GFP的單點突變（S65T）顯著提高了GFP的光譜性質(zhì)，熒光強度和光穩(wěn)定性也大大增強。突變后的GFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488nm，而發(fā)射峰仍保持在509nm，這和常用的FITC濾光片匹配，提高了GFP的應(yīng)用潛力。Heim,R.,Cubitt,A.B.,&TsienR.Y.Improvedgreenfluorescence.Nature.1995Feb23;373(6516):663-4.33改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的核心技術(shù)是基因的人工，目前常用的方法有：M13載體法和PCR擴增法。定點突變M13載體法原理：利用人工合成帶突變位點的寡聚核苷酸作為引物，利用M13噬菌體載體系統(tǒng)合成突變基因。PCR擴增法原理：利用人工合成帶突變位點的誘變引物，通過PCR擴增而獲得定點突變的基因。347.5蛋白質(zhì)工程的應(yīng)用（一）研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）改變蛋白質(zhì)的特性（三）生產(chǎn)