雙熒光素酶報告系統(tǒng)

雙熒光素酶報告系統(tǒng)雙熒光素酶報告基因測試∶結(jié)合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進(jìn)的共報告基因測試技術(shù)在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達(dá)時,通常承受其次個報告基因來削減試驗(yàn)的變化因素。但傳統(tǒng)的共報告基因(比方CAT,β-Gal,GUS)不夠便利,由于各自的測試化學(xué),處理要求,檢測特pRL腔腸熒光素酶,在單管中進(jìn)展雙熒光素酶報告基因測試,快速,靈敏,簡便。系統(tǒng)還供給PLB酶報告基因載體的爭辯人員。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)將使他們馬上體會到該系統(tǒng)的便利。介紹雙報告基因用于試驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測,通常一個報告基因作為內(nèi)比照,使用螢火蟲熒光素酶,結(jié)合氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),β-半乳糖苷酶(β-Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)操作的優(yōu)勢,比方熒光素酶測試和定量可在幾秒鐘內(nèi)進(jìn)展,但CAT,β-GalGUS留意不要超過這些范圍,內(nèi)源性細(xì)胞活力也會干擾這類報告基因的使用。很多類型的細(xì)胞有內(nèi)源β-GalGUSCAT測試。盡管在高溫下預(yù)處理細(xì)胞裂解液(1,2),β-GalCAT理共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解液。抱負(fù)的雙報告基因方法應(yīng)當(dāng)使用戶能夠以螢火蟲熒光素酶所具有的速度,靈敏和線性范CAT,β-GalGUSPhotinuspyralis)和海洋腔腸(Renillareniformis)雙熒光素酶，Promega的雙熒光素酶報告(DLR)系統(tǒng)可滿足這些要求，在單管中完成這些測試。雙熒光素酶報告基因測試化學(xué)熒火蟲和海洋腔腸熒光素酶都具有生物發(fā)光報告基因的卓越的測試特點(diǎn),但它們在進(jìn)化DLR學(xué),選擇性地區(qū)分這兩種發(fā)光報告基因的活力。螢火蟲熒光素酶是一個61kDa單亞基蛋白ATP,Mg2+和O2存在下，通過甲蟲熒光素的氧化反響發(fā)光(圖1)。在常規(guī)反響條件下,熒光素的氧化發(fā)-AMP作為中間體,轉(zhuǎn)換格外緩慢。結(jié)果,在底物和酶混合后,測試化輔酶A(CoA),(5),導(dǎo)致持續(xù)的“閃耀“發(fā)光信號(圖2)。圖1Renilla36kDaRenillareniformis(6)，3%的碳水化合物，但是和螢火蟲熒光素酶一樣，酶活力不需翻譯后修飾，在翻譯后即可O2和海樣腔腸熒光素2)。熒光素酶活力(“試驗(yàn)“報告基因)的測定后，螢火蟲發(fā)光被快速湮滅，并同時激活海洋腔腸熒的兩個報告基因作快速地定量，酶來自轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液，或無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯反響。8≤1fg10-2010fg3×10-19摩爾)的比照報告基3B)，并且這兩個酶的特異活力相像。圖2用雙熒光素酶報告基因測試由螢火蟲和RenillaCHO(1×106/60mmpGL3ControlpRLSV40DNAPBS400μlPLB20μlII(LARII)混合，螢火蟲熒光素酶的活力馬上用熒光照度儀檢測(細(xì)線示蹤)。100μlStop&GloTM試劑參加到熒光照度儀管中，湮滅螢火RenillaRenilla線示蹤)。TurnerDesigns20/2012成兩次測試。雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)的方式小組分或作額外的處理。因海洋腔腸和螢火蟲熒光素酶均呈現(xiàn)閃耀型反響動力學(xué)，作雙熒光素酶報告基因測試不需要有試劑注射器的熒光照度儀。DLR304試時，將一份裂解產(chǎn)物和熒光素酶測試試劑II(LARII)混合。在完成螢火蟲熒光素酶測試Stop&GloTM1，Stop&GloTM試劑湮滅大于105滴度螢火蟲反響的發(fā)光信號(圖5)，并同時激活海洋腔腸熒光素酶。RenillaBSA1×PLBTurnerDesigns210fg100fgRenilla光素酶反響中測試發(fā)光，需減去來自海洋腔腸熒光素自發(fā)光的背景信號。兩種熒光素酶的發(fā)4LuciferaseAssayReagentII(LARII),Stop&GloTM試劑。PLBPLB益于使用常規(guī)處理方法制作的裂解液。無論使用何種裂解方法，對培育的哺乳細(xì)胞而言，釋PLB6)。被動水溶液中的固有特點(diǎn)。通常用來制備細(xì)胞裂解液的試劑可增加海洋腔腸熒光素自發(fā)光，包括Triton?X-100,Promega?(CCLR)和報告基因裂解試劑(RLB)，這些試劑PLB成裂解液并測試。RenillaCHOpGL3-ControlpRLSV40DNA21)和Renilla熒光素酶(報告基因2)活力檢測在102Stop&GloTM1Stop&GloTMRenillaRenilla0.0004%圖6用PLB裂解哺乳細(xì)胞的高效率和被動或主動裂解方法。用pGL3-Control和pRL-SV40DNAPLB，溫存搖動培育15-80℃進(jìn)展1/融循環(huán)(主RenillaDLR4報告基因活力用主動裂解方法對每種細(xì)胞進(jìn)展歸一化。圖A：螢火蟲熒光素酶報告基因活力。B：Renilla海洋腔腸熒光素酶比照載體pRL系列有克隆自Renillareniformis(7cDNA(RlucRluc基因中導(dǎo)3個堿基替換，消退了內(nèi)BglII,BamHI和NarI酶切位點(diǎn)，這些突變不造成海洋腔腸熒光素酶表達(dá)的氨基酸序列的轉(zhuǎn)變。供給的pRL載體有幾種啟動子構(gòu)型，可同螢火蟲熒pRL-TK載體pRL-TK9)Rluc上游含有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-TK)的啟動子區(qū)域。(8,9)。pRL-SV40pRL-SV40SV40/啟動子區(qū)域，在多種細(xì)胞中，可高強(qiáng)度、組成型表SV40COS-1COS-7(10)，可SV40pRL-CMVpRL-CMVCMV/啟動子區(qū)域，在多種細(xì)胞類型中，可高強(qiáng)度、組成中，24pRL-Null載體pRL-nullRluc機(jī)敏性來克隆所需的啟動子序列，啟動海洋腔腸熒光素酶的表達(dá)。9pRL-TKpRLpRL的緊下游是一個嵌合的內(nèi)含子，可供給海洋腔腸熒光素酶的增加表達(dá)。內(nèi)含子由人β-珠蛋白質(zhì)內(nèi)含子1的5′-供體剪切位點(diǎn)和免疫球蛋白基因重鏈可變區(qū)域的分枝點(diǎn)和3′-受體剪切位點(diǎn)組成(12)分枝點(diǎn)的序列均作了轉(zhuǎn)變以匹配最適剪切位點(diǎn)的共有序列(3)RlucT7啟動子序列，可在體外合成海洋腔腸熒光素酶的轉(zhuǎn)錄物。(A)mRNA(14)。載體β-內(nèi)酰胺酶基因，可在大腸桿菌中選擇質(zhì)粒的擴(kuò)增。RenillapRL-SV40DNA6CHO(2.5×105細(xì)胞/孔)。培育30小時后，將培育液吸干，每孔中的附著細(xì)胞用PBS洗滌一次。制備裂解液Renilla22℃(室溫)、4℃，-20℃。保存的樣品在指示的時間間隔內(nèi)重測試。測試按圖532Ampr,E.coli，ori,E.coliRlucAmpr中的箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。小結(jié)在雙遺傳報告基因的應(yīng)用中，一個報告基因活力的轉(zhuǎn)變，與基因表達(dá)的特定試驗(yàn)條件相關(guān)，Promega告基因測試系統(tǒng)，在單管中測試兩個熒光