第十三章 生物物質(zhì)的分離與純化

第十三章生物物質(zhì)的分別與純化1、培育液的預(yù)處置2、培育液的固液分別3、細(xì)胞的破碎4、生物物質(zhì)的分別純化方法5、生物分別工藝引見教學(xué)內(nèi)容補(bǔ)充內(nèi)容〔一〕發(fā)酵醪(發(fā)酵液)的普通特征利用微生物發(fā)酵消費(fèi)各種發(fā)酵產(chǎn)品，由于菌種不同和發(fā)酵醪特性不同，其預(yù)處置方法和提取、精制方法的選擇也有差別。應(yīng)針對發(fā)酵醪的特性來合理選擇處置方法，大多數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在發(fā)酵醪中，也有少數(shù)發(fā)酵產(chǎn)物存在菌體中，或發(fā)酵醪和菌體都含有，例如四環(huán)類抗生素。各種發(fā)酵產(chǎn)物無論在發(fā)酵醪或是在菌中表達(dá)往往濃度較低，并與種種的溶解和懸浮的雜質(zhì)混在一同，要分別提純發(fā)酵產(chǎn)物，首先要針對發(fā)酵醪的特性進(jìn)展預(yù)處置。發(fā)酵醪的特性普通可歸納為：1、發(fā)酵醪大部分是水，普通含量達(dá)90%-99%.2、發(fā)酵醪中發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，雖然由于菌種、原料、工藝條件不同，發(fā)酵產(chǎn)物于發(fā)酵醪中濃度的高低也有差別，但總的來說發(fā)酵醪中發(fā)酵產(chǎn)物濃度都是比較低的，除了酒精、檸檬酸、葡萄糖酸等發(fā)酵產(chǎn)物濃度在10%以上外，其他的都在10%以下，而抗生素的濃度更低，普通在1%以下。3、發(fā)酵醪中的懸浮固體物主要含有菌體和蛋白質(zhì)膠狀物。由于發(fā)酵醪中存在一定數(shù)量的菌體和蛋白質(zhì)膠體物質(zhì)，不僅使發(fā)酵醪粘度添加，不利于過濾，而且添加提取和精制后工序的操作困難，在濃縮過程中變得更粘稠，同時(shí)容易產(chǎn)生泡沫。采用溶媒萃取法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在奪產(chǎn)生乳化，使溶媒相和水相分層困難；采用離子交換法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在也會添加樹脂的吸附量，加重樹脂的負(fù)擔(dān)。4、發(fā)酵醪的培育基殘留成分中還含有無機(jī)鹽類，非蛋白質(zhì)大分子其降解產(chǎn)物對提取和精制均有一定的影響。5、發(fā)酵醪中除了發(fā)酵產(chǎn)物外，常有其他少量的代謝產(chǎn)物。發(fā)酵過程中除了主代謝產(chǎn)物外，尚伴有一些其他的副代謝產(chǎn)物。這些少量的副產(chǎn)物，有時(shí)其構(gòu)造特性與發(fā)酵主產(chǎn)物極為近似，這就會給分別提純操作帶來困難。6、發(fā)酵醪中還含有色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)。雖然它們確實(shí)切組成還不十清楚了，但它們對提煉影響相當(dāng)大。為了保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和衛(wèi)生規(guī)范，應(yīng)經(jīng)過預(yù)處置將色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)先除去。發(fā)酵成熟醪中常含有各種樣的雜質(zhì)，而所需求的發(fā)酵產(chǎn)物那么含量很少。因此，要獲得純真的發(fā)酵產(chǎn)物，它的提取與精制過程便成為一個(gè)復(fù)雜而必不可少的工藝過程。提取和精制的目的在于從發(fā)酵液中制取高純度的、合符質(zhì)量規(guī)范要求的發(fā)酵廢品。雖然由于菌種、發(fā)酵醪的特征及發(fā)酵工藝的不同，發(fā)酵產(chǎn)物可以多種多樣，但從工業(yè)發(fā)酵范疇來看，從發(fā)酵醪中獲得產(chǎn)物大致可分為三類：發(fā)酵產(chǎn)物的分類補(bǔ)充內(nèi)容〔二〕菌體主要以菌體細(xì)胞作為發(fā)酵產(chǎn)品，如單細(xì)胞蛋白、面包酵母、飼料酶母等。此外就是從菌體細(xì)胞中提取有用的發(fā)酵產(chǎn)物，如由酵母細(xì)胞提取輔酶A、核糖核酸等產(chǎn)品。有的抗生素主要存在于菌絲體中，如灰黃霉素產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的灰黃霉素主要在菌絲中，因此，也要從菌絲體中進(jìn)展提取。酶發(fā)酵產(chǎn)物為酶制劑，包括胞外酶和胞內(nèi)酶。如α-淀粉酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、右旋糖酐酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、轉(zhuǎn)化酶、蜜二糖酶、柚苷酶、花青素酶、脂肪酶、凝乳酶、氨基?；浮⑻於彼崦?、青霉素酰胺酶、磷酸二酰酶、天冬酰胺酶等，均在工業(yè)上和醫(yī)藥上發(fā)揚(yáng)作用。代謝產(chǎn)物中間代謝產(chǎn)物包括醋酸、乳、檸檬酸、葡萄糖酸、衣康酸及延胡索酸等。氨基酸發(fā)酵產(chǎn)物包括谷氨酸、賴氨酸、色氨酸等。由于對菌種的變異和氨基酸代謝機(jī)理的研討日益深化，所以其他氨基酸，除蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸外，18種氨基酸均可用直接發(fā)酵法制造。有機(jī)溶劑發(fā)酵產(chǎn)物包括酒精、丙酮、丁醇等。核苷酸類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)物包括肌苷、肌苷酸以及鳥苷酸等。5`-肌苷酸和5`-鳥苷酸均為呈味核苷酸，核酸的微生物包括輔酶A、ATP、輔酶I等均為重要的醫(yī)藥品?？股匕l(fā)酵產(chǎn)物包括青霉素、鏈霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、慶大霉素、新霉素、紅霉素及利福霉素等。多糖發(fā)酵產(chǎn)物包括右旋糖酐及多糖B-1459等。多糖是醫(yī)藥和工業(yè)上重要粘性物質(zhì)來源之一，右旋糖酐經(jīng)過部分水解后供代血漿用。多糖B-1459是水溶性、高分子量的胞外異多糖。維生素發(fā)酵產(chǎn)物有核黃素、維生素C和維生素B12.甾體氧化的產(chǎn)物為甾體激素，是重要的品。如醋酸可的松、氫化可的松、醋酸潑尼松、氫化潑尼松等促皮質(zhì)激素及腎上腺皮質(zhì)激素制劑、黃體酮、甲孕酮〔安宮黃體酮〕等性激素、炔諾酮等避孕藥。問題1、發(fā)酵醪有哪些特性？2、發(fā)酵醪中獲得產(chǎn)物大致可分為、、三類？3、發(fā)酵液中的細(xì)胞代謝產(chǎn)物有哪些？分別舉出2個(gè)詳細(xì)代表產(chǎn)物。生化消費(fèi)過程的最后一個(gè)環(huán)節(jié)是把目的產(chǎn)物從培育液或反響液中分別提取出來。多數(shù)生化產(chǎn)品在消費(fèi)過程中需經(jīng)微生物發(fā)酵、酶反響過程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培育，并經(jīng)過包括產(chǎn)物回收、粗分別、純化及精制等處置后，才干符合一定的質(zhì)量規(guī)范。在生物產(chǎn)品消費(fèi)過程中普通將微生物發(fā)酵、酶反響過程或動(dòng)植物細(xì)胞大量培育稱為“上游過程〞，而與之相應(yīng)的產(chǎn)物回收、粗分別、純化及加工等后續(xù)過程就稱之為“下游過程〞，或稱之為生化分別和純化過程。眾所周知，要使生物技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)化，必需求上下游過程兼容、協(xié)調(diào)、以使全過程能優(yōu)化進(jìn)展。鑒于生化產(chǎn)品具有如下特點(diǎn)：目的產(chǎn)物在初始物料中的含量低；含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除了產(chǎn)物外，還含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培育基、無機(jī)鹽等；生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性差，對PH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、外表張力等非常敏感，易失活、變性；生化產(chǎn)品種類繁多，包括了大、中、小分子量的構(gòu)造和性質(zhì)復(fù)雜又各異的生物活性物質(zhì)；生化產(chǎn)品的運(yùn)用面廣，許多產(chǎn)品用作醫(yī)藥、食品、試劑等，對含量和純度要求高等。因此，運(yùn)用于生化產(chǎn)品的后處置過程中的分別純化技術(shù)必需滿足以下一些要求：條件溫暖，特別對具有生物活性的物質(zhì)，在后處置過程中必需堅(jiān)持其生物活性；分別純化技術(shù)的選擇性好、專注性強(qiáng)，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分別出來，以到達(dá)較高的分別純化倍數(shù)；目的產(chǎn)物的量和活性具有較高的收率；運(yùn)用于生化產(chǎn)品的后處置過程中的分別純化技術(shù)必需滿足以下一些要求：在提高單個(gè)分別技術(shù)的收效率的同時(shí)，留意各單元操作間的有效組合和整體協(xié)調(diào)，以減少工藝過程的步驟；快速，以提高消費(fèi)才干。就目前的開展和運(yùn)用情況來看，在大多數(shù)生物產(chǎn)品的開發(fā)研討中，后處置過程等的研討費(fèi)用約占全部費(fèi)用的50%以上，在產(chǎn)品的本錢構(gòu)成中，后處置本錢占總本錢的40%-80%,對于精細(xì)胞和藥用的產(chǎn)品，此比例就更高。消費(fèi)過程中后處置投入的人力和物力占全部的70%-90%.生物產(chǎn)品的后處置分別純化技術(shù)和工藝不僅影響產(chǎn)品的質(zhì)量和本錢，也決議著產(chǎn)品的產(chǎn)量。生化產(chǎn)品由于沒有適當(dāng)?shù)奶崛?、分別和純化方法或因回收率太低致使消費(fèi)本錢過高而不能投產(chǎn)的例子是屢見不鮮的。不同的生化產(chǎn)品，由于本身的特性及其對純度要求的不同，所采用的分別純化道路經(jīng)常也是不同的。例如從發(fā)酵液中提取和精制菌體和胞內(nèi)酶，就與分別與純化細(xì)胞的代謝產(chǎn)物有明顯的不同；同樣即使產(chǎn)物都屬于代謝產(chǎn)物，由于產(chǎn)物的化學(xué)構(gòu)造不同，其提取和精制的方法也就不同。但普通來說，分別純化道路都包括了兩個(gè)根本階段：產(chǎn)物的初級分別階段；產(chǎn)物的純化精制階段。

初級分別階段在細(xì)胞培育終了之后，其義務(wù)是分別培育液、破碎細(xì)胞釋放產(chǎn)物〔假設(shè)產(chǎn)物在胞內(nèi)〕、溶解包涵體、復(fù)原蛋白質(zhì)、濃縮產(chǎn)物和去除大部分雜質(zhì)等。純化精制階段是在初級分別的根底上，用各種高選擇的手段和方法，將目的產(chǎn)物和干擾雜質(zhì)盡能夠地分開，使產(chǎn)物的純度到達(dá)相關(guān)的要求，成為級別的產(chǎn)品。生物產(chǎn)品的后處置過程普通包括：發(fā)酵液的預(yù)處置；提??；精制三個(gè)步驟。圖13-1生物產(chǎn)品分別純化的普通步驟發(fā)酵液或培育液細(xì)胞產(chǎn)物胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物離心或過濾細(xì)胞〔洗滌〕離心或過濾〔洗滌)離心或過濾〔洗滌〕細(xì)胞破碎〔化學(xué)法機(jī)械法等〕整體細(xì)胞萃取離心、過濾枯燥分別劑回收、再生提取、分別沉淀、吸附、萃取、過濾等分別劑回收、再生純化、精制層析、結(jié)晶、電泳等枯燥廢物產(chǎn)物產(chǎn)物濾液循環(huán)副產(chǎn)物廢物濾渣副產(chǎn)物循環(huán)廢物細(xì)胞濾渣副產(chǎn)物廢物細(xì)胞含產(chǎn)物的清液預(yù)處置階段一、培育液的預(yù)處置問題1、培育液的預(yù)處置的目的是什么？2、培育液的預(yù)處置包括哪些步驟？菌體細(xì)胞的分別固體懸浮物的去除蛋白質(zhì)的去除重金屬離子的去除色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)的去除改善培育液的處置性能調(diào)理適宜的PH和溫度二、培育液的固液分別方法1、分別前的處置加熱由于加熱能夠使某些熱敏感性蛋青絲生不可逆的變性，因此這種預(yù)處置方法僅適用于對非熱敏感性產(chǎn)品發(fā)酵液的預(yù)處置。適當(dāng)加熱之后，發(fā)酵液中的蛋白由于變性而凝聚，構(gòu)成較大的顆粒，發(fā)酵液的粘度就會降低，普通加熱的用65-80調(diào)理PH值適當(dāng)?shù)腜H值可以提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性，減少其在隨后的分別純化過程中的損失。此外，發(fā)酵液PH值的改動(dòng)會影響發(fā)酵液中某些成分的電離程度，從而降低發(fā)酵液的粘度。在調(diào)理PH值時(shí)要留意選擇比較溫暖的酸和堿，以防止部分過酸或過堿。草酸是一種較常用的PH值調(diào)理劑。參與絮凝劑通常情況下，細(xì)菌的外表都帶有負(fù)電荷，可以在發(fā)酵液中參與帶正電荷的絮凝劑，從而使菌體細(xì)胞與絮凝劑結(jié)合構(gòu)成絮狀沉淀，降低發(fā)酵液的上粘度，利于菌體的收獲。序號方法原理設(shè)備1絮凝利用電荷中和及大分子橋聯(lián)作用形成更大的粒子2離心在離心產(chǎn)生的策略場作用下，加快顆粒的沉降速度高速冷凍離心機(jī)蝶片式離心機(jī)管式離心機(jī)傾析式離心機(jī)筐式離心機(jī)3過濾依據(jù)過濾介質(zhì)的空隙大小進(jìn)行分離板框過濾機(jī)平板過濾器真空旋轉(zhuǎn)過濾機(jī)管式過濾器蜂窩式過濾器深層過濾器4膜分離依據(jù)被分離的分子大小和膜孔大小進(jìn)行分離平板、卷曲、中空纖維、管式微孔過濾器平板、卷曲、中空纖維，管式超濾器平板滲透器半透膜型、離子半透膜型電滲析器2、固液分別方法3、碟式離心機(jī)構(gòu)造及任務(wù)原理進(jìn)料輕液出口菌體及固體雜質(zhì)當(dāng)發(fā)酵醪由轉(zhuǎn)鼓中心進(jìn)料入高速旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)鼓內(nèi)，由于固、液比重不同，在碟片空間內(nèi)由于離心力的作用下，把發(fā)酵醪分成固相和液相兩部分。比重較輕的清液有規(guī)那么地沿著碟片的上外表向碟片軸心方向挪動(dòng)，由環(huán)形輕液出口處排出，而比重較大的菌體及濃縮物，那么有規(guī)那么地沿著上一個(gè)碟片的底外表滑移到碟片邊緣，經(jīng)轉(zhuǎn)鼓壁上的噴嘴噴出搜集于菌體搜集器內(nèi)，從而到達(dá)分別菌體的目的。此機(jī)的轉(zhuǎn)速可高達(dá)6000-10000r/min左右。我國廣州重型機(jī)械廠消費(fèi)的DP-400型酵母高速離心分別機(jī)轉(zhuǎn)速為6500r/min，可適用于發(fā)酵工業(yè)的菌體分別。表13-2細(xì)胞破碎方法的分類枯燥處置機(jī)械法非機(jī)械法固體剪切作用流體剪切作用破碎方法溶胞處置珠磨法壓榨法超聲法化學(xué)法物理法高壓勻漿酶溶法三、細(xì)胞的破碎細(xì)胞破碎就是經(jīng)過采用不同手段破壞細(xì)胞外圍使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來，轉(zhuǎn)入液相中，以便于進(jìn)展產(chǎn)物的分別純化。細(xì)胞破碎的方法有很多，按照能否存在在外加作用力可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩大類。如圖13-2為細(xì)胞破碎方法的分類。表13-2列出了主要的細(xì)胞破碎方法的原理，運(yùn)用的設(shè)備、特點(diǎn)和存在的缺陷。表13-2細(xì)胞破碎方法序號方法原理設(shè)備特點(diǎn)缺點(diǎn)1壓力破碎法利用壓力釋放時(shí)的液固剪切進(jìn)行破碎壓力破碎機(jī)操作簡便，可連續(xù)操作，適用于不同的細(xì)胞加壓放熱，需要冷卻，否則生物活性物質(zhì)會失活；破碎率較低，壓力不穩(wěn)定，需要進(jìn)行反復(fù)破碎2珠磨破碎法利用固體的剪切進(jìn)行破碎細(xì)胞珠磨破碎機(jī)操作簡便、穩(wěn)定，可連續(xù)批式操作，破碎率可以控制，容易放大，適用于工業(yè)放大珠磨時(shí)會放熱，需要高效冷卻，不同細(xì)胞的破碎條件差異大3超聲波破碎法利用超聲波形成空穴產(chǎn)生壓力沖擊使進(jìn)行破碎超聲破碎機(jī)操作簡便，可連續(xù)或批式操作超聲波處理會產(chǎn)熱，需要冷卻，破碎率較低，需反復(fù)進(jìn)行破碎，應(yīng)用面較窄4滲透壓法利用滲透壓的突變，造成細(xì)胞內(nèi)壓力差而引起細(xì)胞的破碎適用于位于胞內(nèi)質(zhì)的產(chǎn)物釋放，細(xì)胞的破碎率低，但產(chǎn)物的釋放較好，純度較高操作比較復(fù)雜，條件要求嚴(yán)格，只適用于少量櫚的處理，費(fèi)用高5有機(jī)溶劑或表面活性劑法利用有機(jī)溶劑或表面活性劑改變細(xì)胞壁或膜的通透性，使胞內(nèi)產(chǎn)物得以釋放方法簡單，細(xì)胞內(nèi)含物釋放少，產(chǎn)物較純，可大規(guī)模應(yīng)用適用性有限，只適合于對有機(jī)溶劑或表面活性劑穩(wěn)定的產(chǎn)物6堿或酶處理法經(jīng)堿或酶的處理使細(xì)胞壁或膜破壞，使產(chǎn)物釋放出來方法簡單，可大規(guī)模應(yīng)用適用性有限，只適合于對堿或酶穩(wěn)定的產(chǎn)物問題細(xì)胞破碎的方法的詳細(xì)有哪些？四、生物物質(zhì)的分別純化方法發(fā)酵產(chǎn)物的提取和精制過程也就是濃縮和純化過程，普通包括：發(fā)酵液的預(yù)處置；提??；精制三個(gè)步驟。在提取前還必需使菌體、懸浮固形物、固體發(fā)酵液開，即進(jìn)展過濾或離心分別，并參與一些物質(zhì)或采取一些措施，以改動(dòng)發(fā)酵液的性質(zhì)，便于以后的提取，這過程稱為發(fā)酵液的預(yù)處置。由于發(fā)酵液體積大，發(fā)酵液中的發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，一步操作遠(yuǎn)不能滿足要求，而常要好幾步操作。其中第一步操作從發(fā)酵液中分別提取發(fā)酵產(chǎn)物最為重要，稱為提取。而以后幾步操作所處置的體積小了，操作要容易些，主要將發(fā)酵產(chǎn)物部分除去雜質(zhì)、濃縮、提純及精煉，這過程統(tǒng)稱精制。用于生物物質(zhì)分別、純化的方法除了傳統(tǒng)的沉淀法、吸附法、離子交換、萃取法等之外，還有超濾、反浸透、電滲析、凝膠電泳、離子交換層析、新和層析、疏水層析、等電聚焦、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠團(tuán)萃取、凝膠層析等。表13-3、表13-4、表13-5分別列出了一些生物分別純化技術(shù)及其它們的特點(diǎn)、經(jīng)濟(jì)性。表13-3主要的生物分別純化技術(shù)一覽表分離純化技術(shù)開發(fā)現(xiàn)狀典型產(chǎn)物產(chǎn)物回收率選擇性產(chǎn)物產(chǎn)出形式蒸餾工業(yè)化揮發(fā)性物質(zhì)高回收所有的揮發(fā)性物質(zhì)，選擇性低產(chǎn)物濃溶液濃縮加熱法

超濾法工業(yè)化非揮發(fā)性物質(zhì)分子量大于50000的物質(zhì)取決于產(chǎn)物的穩(wěn)定性高無選擇性去除所有低分子量化合物去除揮發(fā)性組分的濃縮發(fā)酵液濃縮且部分純化的發(fā)酵液萃取溶劑（傳統(tǒng)）溶劑（離子對）

雙水相分配雙水相+液膜工業(yè)化半工業(yè)化小規(guī)模工廠生產(chǎn)溶劑可溶性物質(zhì)溶劑可溶的，且必須有適當(dāng)?shù)目购怆x子的物質(zhì)大分子量物質(zhì)潛力大，產(chǎn)物范圍廣中高中潛力大去除所有不能溶于溶劑的化事物較好選擇性中等選擇性潛力很大產(chǎn)物與溶劑的混合溶液產(chǎn)物與平衡離子溶劑的混合溶液溶解在聚乙二醇中的產(chǎn)物溶液溶劑和產(chǎn)物溶液的乳人液沉淀、過濾或離心工業(yè)化產(chǎn)物的不溶性衍生物高選擇性較高產(chǎn)物不溶衍生物的濃漿吸附工業(yè)化大分子量及不穩(wěn)定物質(zhì)中選擇性高，甚至是專一性以溶液存在于洗脫液中問題請列舉出生物物質(zhì)分別純化的方法〔至少5個(gè)〕？五、生物分別工藝引見生物產(chǎn)品的商品化，除了必需有良好、高效的生物分別純化的方法外，還必需對這些方法進(jìn)展合理的安排，以得到可用于大規(guī)模消費(fèi)的、具有良好的經(jīng)濟(jì)的性的生物分別工藝。為了獲得優(yōu)化的生物分別工藝，保證消費(fèi)目的的實(shí)現(xiàn)，設(shè)計(jì)詳細(xì)工藝前普通需求思索以睛的總體概念：P246純度和質(zhì)量本錢利用微生物、工程菌進(jìn)展發(fā)酵或動(dòng)植物細(xì)胞培育、酶反響等進(jìn)展生物產(chǎn)品的上游過程中的各種要素均對分別純化的方法和分別工藝有直接的影響。P246共7點(diǎn)

生化產(chǎn)品的大規(guī)模消費(fèi)對分別純化技術(shù)和生物分