腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究

腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究目的：本研究通過對86株碳青霉烯類抗生素耐藥或敏感性降低的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行β-內(nèi)酰胺酶、外膜蛋白和外排泵檢測,旨在闡明腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的分子機(jī)制；通過碳青霉烯酶基因周圍序列分析,探討碳青霉烯耐藥基因的傳播機(jī)制。方法：瓊脂稀釋法測定抗生素對細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)。脈沖場凝膠電泳和腸桿菌基因間重復(fù)性一致序列-PCR(ERIC-PCR)分析菌株之間的同源性。等電聚焦電泳、PCR擴(kuò)增和序列分析確定菌株所產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的類型。質(zhì)粒接合試驗、質(zhì)粒消除試驗和Southernblot雜交驗證碳青霉烯耐藥基因是否位于質(zhì)粒上。提取細(xì)菌的外膜蛋白作十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS),檢測外膜蛋白表達(dá)情況。羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制試驗檢測細(xì)菌中是否存在針對碳青霉烯類抗生素的外排泵。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindⅢ對碳青霉烯酶基因編碼質(zhì)粒進(jìn)行酶切分型。對部分碳青霉烯酶基因編碼質(zhì)粒進(jìn)行測序,分析碳青霉烯酶基因周圍DNA序列的基因結(jié)構(gòu)。結(jié)果：86株菌株對碳青霉烯有不同程度的耐藥,亞胺培南、美羅培南和厄他培南的敏感率分別為43.0%、44.2%和1.2%,其它β-內(nèi)酰胺類抗生素和環(huán)丙沙星的耐藥率和耐藥水平均很高,多粘菌素B的敏感率最高(92.9%),阿米卡星次之(80.2%)。同一醫(yī)院內(nèi)的菌株多數(shù)具有同源性,存在克隆傳播現(xiàn)象。82株菌株產(chǎn)KPC-2型碳青霉烯酶,5株產(chǎn)IMP型金屬β-內(nèi)酰胺酶(其中3株同時產(chǎn)KPC-2),2株檢測不到碳青霉烯酶。TEM-1、SHV-11／-12和CTX-M-14／-M-3等β-內(nèi)酰胺酶的檢出率非常高,大部分菌株同時產(chǎn)多種酶。大多數(shù)菌株可通過接合試驗將碳青霉烯耐藥性傳遞給大腸埃希菌。Southernblot雜交顯示blaKPC-2基因位于50kb的可接合質(zhì)粒上。4株肺炎克雷伯菌(包括2株檢測不到碳青霉烯酶的菌株)由于ompK36基因中存在插入序列或堿基突變而缺失OmpK36膜孔蛋白,一株陰溝腸桿菌缺失一個38kDa的外膜蛋白,弗勞地檸檬酸桿菌的兩個外膜蛋白表達(dá)量均明顯下降。CCCP不能降低亞胺培南對細(xì)菌的MIC值。82株產(chǎn)KPC-2菌株的blaKPC-2基因編碼質(zhì)?？筛鶕?jù)EcoRI和HindⅢ的限制性酶切圖譜分為11種類型(Ⅰ型-Ⅺ型),大部分質(zhì)粒(62／82)為Ⅰ型,其次為Ⅴ型(8／82)。選?、裥?pKP1)和V型(pKP20)質(zhì)粒各一個進(jìn)行測序,pKP1質(zhì)粒獲得7788bp的DNA序列,pKP20為6000bp。兩個質(zhì)粒的blaKPC-2基因周圍序列中均含有多個轉(zhuǎn)座相關(guān)元件。pKP1質(zhì)粒依次編碼Tn3轉(zhuǎn)座酶、Tn3解離酶、ISKpn8轉(zhuǎn)座酶、KPC-2和ISKpn6-like樣轉(zhuǎn)座酶等蛋白。pKP20質(zhì)粒依次編碼IS26轉(zhuǎn)座酶、Tn3解離酶截短蛋白、ISKpn8轉(zhuǎn)座酶、KPC-2、ISKpn6樣轉(zhuǎn)座酶截短蛋白和IS26轉(zhuǎn)座酶等,其中Tn3解離酶截短蛋白、ISKpn8轉(zhuǎn)座酶、KPC-2和ISKpn6樣轉(zhuǎn)座酶截短蛋白基因等部分與pKP1質(zhì)粒相同(共3354bp)。根據(jù)pKP1和pKP20質(zhì)粒的DNA序列設(shè)計引物對其它80個blaKPC-2基因編碼質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn),大部分質(zhì)粒(69／82)的PCR擴(kuò)增結(jié)果與pKP1質(zhì)粒相同,8個Ⅴ型質(zhì)粒的PCR結(jié)果與pKP20質(zhì)粒相同。除3個質(zhì)粒外,其余質(zhì)粒均具有共同的3354bp序列。另外2個質(zhì)粒中檢測到了2種變異體。結(jié)論：同一家醫(yī)院內(nèi)碳青霉烯類抗生素耐藥的腸桿菌科細(xì)菌主要以克隆株的形式傳播。碳青霉烯酶尤其是KPC-2的產(chǎn)生是腸桿菌科細(xì)菌對碳青霉烯耐藥的主要原因,碳青霉烯酶合并膜孔蛋白缺失或低表達(dá)可引起碳青霉烯高水平耐藥,超廣譜β-內(nèi)酰胺酶合并OmpK36缺失也可導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯耐藥或敏感性下降。相同的blaKPC