大白菜離體再生中LBD基因的作用和春化相關BrVIN3基因的遺傳轉(zhuǎn)化

大白菜離體再生中LBD基因的作用和春化相關BrVIN3基因的遺傳轉(zhuǎn)化大白菜作物屬十字花科蕓薹屬作物,通常被認為是再生率低和難以遺傳轉(zhuǎn)化的作物。提高離體再生頻率,建立高效離體再生體系是利用基因工程改良大白菜作物的關鍵。植株再生涉及到胚性愈傷組織產(chǎn)生、體細胞胚發(fā)生和不定芽/根生長等過程,其中胚性愈傷組織產(chǎn)生是關鍵的起始環(huán)節(jié),而LBD是促進胚性愈傷組織發(fā)生的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。本研究以37份白菜高代自交系為材料,參照前人的不定芽再生體系并稍作優(yōu)化,對不同材料的不定芽再生頻率進行統(tǒng)計,獲得7個再生頻率高的優(yōu)良自交系;繼而選用再生頻率差異大的材料,通過熒光定量PCR測定大白菜愈傷組織發(fā)生過程中LBD基因的表達模式,初步分析了LB基因表達對外植體愈傷組織的產(chǎn)生和再生頻率的影響。主要結(jié)果如下:1.選用白菜類(大白菜和小白菜)作物子葉再生體系進行芽再生頻率統(tǒng)計,結(jié)果表明不同品系材料的不定芽再生率差異巨大,再生率最低為0%,最高可達到67.2%。2.選用再生率為2.4%的21#(來源于雜一代品種’刑都優(yōu)豐’)和55.7%的29#(源于雜一代品種’夏寶’)自交系為材料,利用熒光定量PCR在愈傷培養(yǎng)的0d、7d、14d、21d四個時間點檢測白菜LBD基因的表達。結(jié)果表明,白菜外植體在誘導產(chǎn)生愈傷組織的過程中,LBD基因四個時間點的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢;再生頻率不同的材料其LBD基因的表達量也不同。3.選用4份再生率有明顯差異的自交系材料,進一步驗證了上述LBD基因在愈傷組織發(fā)生過程的表達規(guī)律。并且研究表明外源激素能顯著誘導白菜LBD基因表達量的增高,有效促進材料愈傷組織的形成。在建立的子葉再生體系的基礎上,本研究成功建立大白菜子葉培養(yǎng)農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用本研究組基于全基因組關聯(lián)分析GWAS(Genome-Wideassociationstudy)和傳統(tǒng)QTL(Quantitativetraitlocus)遺傳定位,在A02染色體上定位了一個與白菜抽薹開花密切相關的候選基因—BrVIN3(Bra006824)。為驗證Bra006824功能,本研究利用上述篩選獲得的再生頻率高的自交系材料,采用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化法將目的基因Bra006824轉(zhuǎn)入相應植株中;利用相同的農(nóng)桿菌采用浸花法將基因?qū)霐M南芥并進行表型調(diào)查分析,結(jié)果顯示:1.在再生過程中,外植體再生芽對潮霉素的最高耐受濃度是3mg/L;利用該濃度進行抗性芽篩選,初步獲得5株經(jīng)過PCR驗證的轉(zhuǎn)基因植株。2.利用農(nóng)桿菌浸花法將抽薹相關