【多肽化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢驗(yàn)探究8700字（論文）】

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果第3章實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與結(jié)果3.1多肽化合物的體外表征3.1.1多肽化合物的質(zhì)譜結(jié)果Comp.1：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.63；Comp.2：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.83；Comp.3：MALDI-TOF:calcM+=2205.8815，obsvd(M+H)+=2207.94；Comp.4：MALDI-TOF:calcM+=2125.9152，obsvd(M+H)+=2127.75。結(jié)果表明，我們成功制備合成了所設(shè)計(jì)的化合物Comp.1、Comp.2、Comp.3，Comp.4。3.1.2多肽化合物的轉(zhuǎn)化率我們通過(guò)LC-MS測(cè)得在不同時(shí)間點(diǎn)，去磷酸化后的三種多肽化合物的轉(zhuǎn)化率。從圖2中可以看出多肽Comp.1在4h轉(zhuǎn)化90%左右；Comp.2在1h中后可快速轉(zhuǎn)化60%，之后轉(zhuǎn)化速率降低，在4h后也只能轉(zhuǎn)化74%左右；Comp.3相對(duì)其他兩組轉(zhuǎn)化得更加緩慢，4h只能轉(zhuǎn)化55%左右。我們猜想這應(yīng)該是由于不同磷酸化位點(diǎn)，而引起的轉(zhuǎn)化率不同。圖3.1多肽化合物的轉(zhuǎn)化率3.1.3臨界聚集濃度(CAC)為判斷不同化合物的組裝能力，采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分別測(cè)定了多肽化合物Comp.1、2、3和4的臨界聚集濃度。如圖3所示，我們可以得出Comp.1的CAC值最低，在85.7uM左右；CAC值約為89.6μM的Comp.2次之，Comp.3的CAC值約為105.4μM，這可能是由于磷酸化位點(diǎn)的不同而導(dǎo)致臨界聚集濃度的差異。與之相比，不帶磷酸化的多肽Comp.4的CAC值則更加的高，約為130.7μM。由此可見，Comp.1具有最出色的組裝能力。圖3.2多肽化合物的CAC圖表3.1.4多肽化合物的體外酶響應(yīng)性研究我們通過(guò)透射電子顯微鏡觀察加入堿性磷酸酶(ALP)前后，三種多肽化合物的微觀形貌變化，這有助于更好地發(fā)現(xiàn)和說(shuō)明宏觀變化的內(nèi)在因素。圖3.3顯示，Comp.1與Comp.2的PBS溶液中存在直徑6nm~7nm的較為粗短的納米原纖維結(jié)構(gòu)，而Comp.3的PBS溶液中納米纖維分布較為疏松。此后，我們將ALP添加到Comp.1、2、3的PBS溶液中37℃孵育，電鏡結(jié)果顯示它們分別形成50nm~70nm左右的納米纖維，分布致密且有較多的交聯(lián)節(jié)點(diǎn)。圖3.3ALP催化前后的多肽化合物的微觀形貌3.1.5多肽化合物與EGFR受體的結(jié)合如圖3.4所示，多肽Comp.1在轉(zhuǎn)化之前的與EGFR生長(zhǎng)因子的結(jié)合常數(shù)為51.44μM,而其他帶有不同磷酸化位點(diǎn)的多肽化合物分別為3.11μM、7.52μM，Comp.1約為它們的17倍、7倍，與EGF蛋白結(jié)合常數(shù)(459.89nM)相比差距較大。由圖3.5可得，當(dāng)加入ALP之后，實(shí)現(xiàn)多肽上酪氨酸的去磷酸化，Comp.1組為738μM，明顯低于未加ALP的組別，也展現(xiàn)出了與EGF蛋白相似的結(jié)合常數(shù)。酶促自組裝策略可以提高－YHWYGYTPQNVI－與EGFR受體的結(jié)合選擇性，同時(shí)也說(shuō)明只有在正確的位點(diǎn)才能提高EGFR結(jié)合的選擇性。圖3.4多肽化合物、EGF蛋白與EGFR受體的結(jié)合常數(shù)圖3.5去磷酸化的多肽與EGFR受體的結(jié)合常數(shù)3.2多肽化合物在細(xì)胞水平上對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢驗(yàn)3.2.1模式細(xì)胞的選擇本課題通過(guò)商用抗體對(duì)幾種不同細(xì)胞系的胞外堿性磷酸酶ALP與EGFR受體的豐度進(jìn)行檢測(cè)，以此篩選并確定最終的模型細(xì)胞即最高表達(dá)量ALP與EGFR的腫瘤細(xì)胞。如圖3.6（a）所示，隨著時(shí)間變化，ALP與底物相應(yīng)的吸收值增加；同時(shí)，在時(shí)間點(diǎn)上的斜率越大，說(shuō)明ALP的相對(duì)含量也越大。SCC15、UMI、TSCCA和CAL-27腫瘤細(xì)胞的胞外ALP酶含量較高且這四種細(xì)胞系A(chǔ)LP含量差異較小，這幾種頭頸部腫瘤細(xì)胞的胞外ALP的含量均高于HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。在圖3.6（b）中，左側(cè)是平均熒光強(qiáng)度，右側(cè)是陽(yáng)性細(xì)胞比例(即抗體標(biāo)記的細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的比例)；可以看出TSCCA的EGFR豐度最大，其次是HN4。綜合兩者ALP與EGFR豐度結(jié)果來(lái)看，本課題選定TSCCA作為我們的模型細(xì)胞，以此與不同的多肽化合物培養(yǎng)從而選擇最佳的多肽序列。(a)(a)(b)Cells圖3.6(a)不同細(xì)胞外ALP與顯色底物作用的吸收值；(b)不同細(xì)胞中針對(duì)EGFR受體的平均熒光強(qiáng)度(左)與陽(yáng)性細(xì)胞比例(右)3.2.2基于TSCCA細(xì)胞的最優(yōu)多肽選擇本課題用不同多肽序列Comp.1、2、3、4與該腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并檢測(cè)哪一種序列能在細(xì)胞周圍有效形成納米纖維，以此確定最優(yōu)多肽序列。通過(guò)共聚焦顯微鏡的直觀觀察，與其他化合物相比，多肽Comp.1熒光強(qiáng)度最高，在TSCCA腫瘤細(xì)胞周圍聚集，由此推測(cè)，不同的磷酸化位點(diǎn)能影響多肽化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，而其中Comp.1的多肽序列能更好地在腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)酶促自組裝而形成納米纖維，因此確定Comp.1作為本課題的最優(yōu)多肽。圖3.7不同多肽化合物培養(yǎng)TSCCA細(xì)胞的共聚焦成像3.2.3最優(yōu)多肽對(duì)不同細(xì)胞的檢測(cè)將多肽化合物Comp.1與多種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證該多肽化合物對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞的選擇性，如圖3.8所示，這些細(xì)胞所得的MFI很明顯高于空白對(duì)照，即說(shuō)明該策略中對(duì)不同細(xì)胞的EGFR檢測(cè)的普適性；而其中TSCCA細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度最高，也驗(yàn)證了Comp.1對(duì)TSCCA細(xì)胞的高選擇性。圖3.8多肽Comp.1培養(yǎng)的不同細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度與空白對(duì)照結(jié)論本課題根據(jù)人舌鱗癌細(xì)胞TSCCA的細(xì)胞膜外過(guò)表達(dá)堿性磷酸酶(ALP)以及細(xì)胞膜上過(guò)表達(dá)的受體EGFR的特點(diǎn)，將響應(yīng)ALP的磷酸化酪氨酸(pY)與響應(yīng)EGFR的多肽序列-YHWYGYTPQNVI-相結(jié)合，最終設(shè)計(jì)與合成能實(shí)現(xiàn)酶促自組裝的多肽化合物。這種多肽化合物Comp.1可響應(yīng)細(xì)胞外的堿性磷酸酶而發(fā)生自組裝行為，形成直徑約為60nm~70nm的納米纖維，且與EGFR膜受體結(jié)合性良好。在細(xì)胞水平上，首先，我們根據(jù)EGFR以及胞外ALP的表達(dá)量，確定模型細(xì)胞TSCCA。由于多肽的封端NBD的熒光性，觀察到該化合物能在細(xì)胞周圍或細(xì)胞膜表面進(jìn)行原位自組裝形成納米纖維，從而確定多肽Comp.1具有良好的胞外富集度，驗(yàn)證了其自組裝行為以及在細(xì)胞周圍的分布情況。另一方面，再將多肽Comp.1與多種細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證了該多肽化合物對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞的選擇性。酶促自組裝策略構(gòu)建了一種能夠靶向腫瘤細(xì)胞的納米材料，并能通過(guò)熒光分子實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的高選擇性檢測(cè)，可為個(gè)性化醫(yī)療提供相應(yīng)的理論支持。本課題結(jié)合多肽合成、納米材料、細(xì)胞工程等學(xué)科領(lǐng)域，體現(xiàn)出交叉學(xué)科的特點(diǎn)，拓寬了基于多肽自組裝材料的應(yīng)用范圍，為制備新型納米藥物遞送體系開發(fā)了新的策略與研究方向。盡管有許多開創(chuàng)性工作已證明了酶促自組裝策略在制備超分子納米材料中的重要性，但仍然面臨各種挑戰(zhàn)。為了實(shí)現(xiàn)酶促自組裝原位形成納米材料，大多數(shù)工作都是在腫瘤細(xì)胞上進(jìn)行的，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，還可通過(guò)識(shí)別在其他疾病部位表達(dá)水平升高的酶來(lái)進(jìn)行自組裝，開發(fā)出對(duì)這類疾病的診斷或治療方法。同時(shí)，大多數(shù)報(bào)道的例子都用一種酶來(lái)證明，而由兩種酶構(gòu)建或控制的超分子納米材料可能對(duì)目標(biāo)細(xì)胞和器官顯示出更高的選擇性，這也要求我們對(duì)酶催化多肽折疊和自組裝的機(jī)理的理解更深。另一方面，還存在著許多其他誘導(dǎo)多肽自組裝的方法，若將它們與酶促自組裝策略結(jié)合，可能會(huì)以更可控的方式形成納米材料。而迄今為止，大多數(shù)工作都是在體外進(jìn)行的，因此，酶促自組裝策略的體內(nèi)應(yīng)用也待研究。參考文獻(xiàn)[1]李沙沙.七甲川菁類比率型熒光探針的構(gòu)建及其在生物酶活性分析中的應(yīng)用[D].青島科技大學(xué).[2]袁禮彬.新型腫瘤血管生成抑制劑來(lái)那度胺衍生物的設(shè)計(jì)與合成[D].北京工業(yè)大學(xué),2015.[3]王娟,鄒千里,閆學(xué)海.肽超分子自組裝:結(jié)構(gòu)調(diào)控和功能化[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2017,75(10):10.[4]苗小明.具有氧化還原響應(yīng)性的含硒小分子多肽自組裝體系[D].南開大學(xué).2011.[5]張從柔.多肽基納米材料用于腫瘤的診斷和治療研