微生物快速檢測 1節(jié) 食品微生物 計數(shù) 1

1第二章食品致病微生物

快速檢測方法浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院趙廣英2內(nèi)源性：致病微生物（非健康/健康）非致病菌條件致病菌外源性：環(huán)境體表在此，只介紹影響食品安全之微生物的定量和定性的快速檢測臘樣芽孢桿菌食品中微生物的主要來源？3第一節(jié)微生物數(shù)量的快速檢測第二節(jié)致病微生物種類的快速檢測4第一節(jié)

食品微生物數(shù)量的快速檢測1浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院趙廣英5學(xué)時數(shù)：1節(jié)1：1學(xué)時＋1節(jié)2：1學(xué)時

n教學(xué)目的：了解和掌握三大類（活菌細胞計數(shù)方法、用于估計微生物數(shù)量的新方法和其他方法各種）細菌等微生物計數(shù)方法中的各種計數(shù)方法。n重點：上課時強調(diào)重點的快速計數(shù)方法。n難點：真正系統(tǒng)掌握并記住上述重點知識并應(yīng)用。

6第一節(jié)微生物數(shù)量的快速檢測1

檢測食品中微生物的數(shù)量可成為評價食品質(zhì)量和衛(wèi)生狀況的科學(xué)依據(jù)。

常規(guī)檢測：“菌落總數(shù)測定”

“霉菌和酵母數(shù)的測定”

“大腸菌群測定”

“大腸桿菌檢測

“糞大腸菌群檢測”

“金黃色葡萄球菌檢測”

都是指的活細胞計數(shù)常用培養(yǎng)來檢測，故慢而繁瑣?，F(xiàn)代（改進的或新的）方法：可以快速、簡便，甚至現(xiàn)場檢測。評價食品品質(zhì)評價食品衛(wèi)生狀況一、活菌細胞計數(shù)的改進方法二、用于估計微生物數(shù)量的新方法

三、其他方法8一、活細胞計數(shù)的快速檢測方法

1．旋轉(zhuǎn)平皿計數(shù)方法2．疏水性柵格濾膜法(HGMF)

或等格法(ISO-GRIDmethod)

3．皿膜系統(tǒng)(Pertrifilm)4．專有酶底物技術(shù)(ColiComplete)5．直接外熒光濾過技術(shù)(DEFT)

6．“即用膠”系統(tǒng)(SimPlate)9旋轉(zhuǎn)(螺旋)平皿計數(shù)方法(spiralplantingmethod)：

用螺旋平板注入器，把液態(tài)樣品螺旋式并不斷稀釋地接種到一個旋轉(zhuǎn)的平皿中，36℃土1℃培養(yǎng)48h+3h后，觀測計數(shù)。

1．旋轉(zhuǎn)(螺旋)平皿計數(shù)方法10螺旋平板原理平皿旋轉(zhuǎn)接種針往外移動同時自動將樣品稀釋1000倍11Rapidcolonyenumerationwith"SpiralSystem?"SprialPlater+旋轉(zhuǎn)接種儀視頻網(wǎng)址：

12螺旋平板法DWS螺旋平板接種儀aColyte自動菌落計數(shù)儀13螺旋平板法的優(yōu)缺點優(yōu)點：與傳統(tǒng)方法相比，無需稀釋3個梯度，每個梯度倒2個平板，節(jié)省了大量人力物力。缺點：檢測時間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48h。需要配合自動菌落計數(shù)儀，否則人工計數(shù)更麻煩。儀器比較貴疏水性柵格濾膜法(HGMF)/薄膜計數(shù)法/等格法(ISO-GRIDmethod)

（1）原理：用疏水性柵格濾膜(HGMF)過濾樣品，放置在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，觀察細菌、酵母菌或霉菌菌落。疏水性的柵格作為柵欄以防止菌落的擴散保證了所有菌落都是正方形的，從而便于人工或機械計數(shù)。

濾膜法常用于可過濾樣品的微生物檢測2．疏水性柵格濾膜法(HGMF)/薄膜計數(shù)法

/等格法15（2）儀器設(shè)備:HGMF過濾裝置

（3）步驟：

①樣品稀釋

②粗濾：通過5

m的不銹鋼預(yù)過濾器過濾，過濾掉可能引起微生物分析誤差的樣品殘渣顆粒。

③細濾：通過0.45

m的疏水性濾膜過濾（含1600個小方格）

0.22

m更好！

④培養(yǎng)：將濾膜放在特定的瓊脂培養(yǎng)板上培養(yǎng)

⑤鑒別和記數(shù)16（4）優(yōu)缺點：優(yōu)點：靈敏度增大，菌落無擴散情況，便于計數(shù)快速、簡便、重復(fù)性好。缺點：需要額外的支出購買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對菌數(shù)要求特別嚴格的產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。17

（5）適用范圍：依培養(yǎng)基不同適于沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7、酵母、霉菌、大腸菌群及大腸桿菌的計數(shù)和檢測。

（6）經(jīng)AOAC*認可的此類方法主要有：AOAC公定方法986．32《食品中的需氧平板計數(shù)疏水性柵格濾膜法》；AOAC公定方法983．25《食品中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌疏水性柵格濾膜法》AOAC公定方法995．21《食品中的酵母和霉菌計數(shù)-疏水性柵格濾膜法(1SO-GRID)使用YM-11瓊脂方法》。

*AOAC：(AssociationofOfficialAnalyticalChemists)即美國分析化學(xué)家協(xié)會，國際公職分析化學(xué)家協(xié)會薄膜計數(shù)法薄膜——微孔濾膜（φ0.45um）（2）濾膜培養(yǎng)膜有菌面沖上原理——膜抽濾（細菌濃縮）+膜平板培養(yǎng)

+

計數(shù)（1）抽濾（濾器及膜事先滅菌）（3）統(tǒng)計計數(shù)提問：假如測出250個菌落，抽濾了50ml自來水，自來水中菌濃度是多少呢？

250÷50ml=5個/ml自來水樣品中的細菌數(shù)量=菌落數(shù)÷抽濾樣品的體積數(shù)要求——樣品潔凈如空氣或飲用水。？堵孔、菌太多難以分散提問：如何用活菌計數(shù)法測定較臟的水樣？減少濾液體積、無菌水稀釋203．皿膜系統(tǒng)(Pertrifilm)皿膜系統(tǒng)，如Pertrifilm3MSystem，可用于菌落總數(shù)、大腸菌群、大腸埃希氏菌、霉菌、酵母和金黃色葡萄球菌計數(shù)?？捎嫈?shù)、定性和定量

21(1)原理

如下圖所示，在一雙層膜系統(tǒng)內(nèi)含有干燥的營養(yǎng)物質(zhì)(類似平板計數(shù)瓊脂或其他的選擇性培養(yǎng)基成分)和冷水可溶的膠體物質(zhì)，以每系統(tǒng)lmL的加樣量將樣品(稀釋或未經(jīng)稀釋的樣品)直接加到基礎(chǔ)膜中間，蓋上含有膠凝劑和TTC的覆蓋膜，培養(yǎng)后細菌在雙層膜之間生長并顯色即可直接計數(shù)。22薄膜粘合劑＋指示劑冷水可溶性凝膠印有格子紙片標準選擇性培養(yǎng)基粘合劑3MPetrifilm的結(jié)構(gòu)23

(2)皿膜系統(tǒng)

(Pertrifilm)的

種類：242526（3）步驟：

27自動判讀儀28（4）代表方法：

AOAC986.33《牛奶中的細菌和大腸菌群計數(shù)》；AOAC989.10《乳品中的細菌和大腸菌群計數(shù)》；AOAC990.12《食品中需氧平板計數(shù)》；AOAC991.14《食品中大腸菌群和大腸艾希氏菌計數(shù)》AOAC996.02《乳制品中的大腸菌群計數(shù)》；AOAC997.02《食品中酵母和霉菌計數(shù)(Pertrifilm’”方法)》

GB第三法大腸桿菌PetrifilmTM測試片計數(shù)法

GBT4789.38-2008注意判讀

1.大腸桿菌PetrifilmTM

測試片上藍色有氣泡的菌落確認為大腸桿菌，不論藍色的深淺，部分藍色的帶氣泡菌落也判定為大腸桿菌。

2.圓形培養(yǎng)膜邊緣及邊緣以外的菌落不計數(shù)。3.當測試片出現(xiàn)大量氣泡、不明顯的小菌落，培養(yǎng)區(qū)呈藍色時，需要進一步稀釋樣品勻液，重新檢驗。1.測試片上的菌落數(shù)都小于15，計數(shù)最低稀釋度測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)2.如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，以“小于1乘以最低稀釋倍數(shù)”報告3.如果所有稀釋度的菌落數(shù)都大于150，計數(shù)最高稀釋度測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告稀釋文本文本選擇菌落數(shù)在15～150之間的稀釋度，兩張測試片菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數(shù)，以CFU/g(CFU/mL）表示。計數(shù)規(guī)則大腸桿菌測試片計數(shù)的報告

32附：餐飲具衛(wèi)生測定－“紙片法”紙片法是目前被廣泛接受的方法。國標餐具大腸菌群采用的就是紙片法。優(yōu)點：無需制備培養(yǎng)基，攜帶方便，非漫延菌落計數(shù)較方便。缺點：不能節(jié)省檢測時間。檢測成本相對偏高。大腸菌群紙片存在與MPN法無法對應(yīng)的問題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目前僅細菌總數(shù)紙片有一些用戶。餐飲具大腸菌群檢測紙片使用說明摘自國家GB14934-94餐（飲）具消毒衛(wèi)生標準

、采樣方法

隨機抽取消毒后準備使用的各類食具(碗、盤、杯等)，取樣量可根據(jù)大、中、小不同飲食行業(yè)每次采樣6～10件，每件貼紙片兩張，每張紙片面積25cm2(5cm×5cm)用毛細吸管吸取無菌生理鹽水濕潤大腸菌群檢測用紙片后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30秒后取下，置于無菌塑料袋內(nèi)?？曜右?只為一件樣品，用無菌生理鹽水濕潤紙片后，立即將筷子進口端約5cm)抹試紙片，每件樣品抹拭兩張，放入無菌塑料袋內(nèi)。2）檢驗方法將已采樣的紙片置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h，若紙片保持紫藍色不變或有紅色斑點但斑點周圍無黃暈為大腸菌群陰性，在紅色斑點周圍有黃暈或紙片變黃并在黃色背景上呈現(xiàn)紅色斑點或片狀紅暈為陽性。3

）

衛(wèi)生指標

在2×25cm2的紙片上（即兩片紙片上），不得有大腸菌群陽性結(jié)果出現(xiàn)。如圖：陽性結(jié)果（滿視野）餐飲具衛(wèi)生（大腸菌群）現(xiàn)場采樣檢測箱使用說明

操作方法：將100%酒精倒入酒精燈中，用酒精燈將鑷子和剪刀頭部消毒。2.用酒精棉球?qū)⑹窒尽?.用酒精棉球?qū)⒈砻婷螅ㄅ囵B(yǎng)皿）擦拭消毒，待酒精揮干后，倒入適量專用生理鹽水。4.剪開檢測紙片外包裝，用鑷子取出紙片，沾取專用生理鹽水后，立即貼于食具內(nèi)側(cè)表面，30秒后取下，置于原塑料袋內(nèi)。5.將裝有紙片的塑料袋置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18h觀察結(jié)果。配置：檢測紙片50份,專用生理鹽水2袋,鑷子2把,剪刀1把，酒精燈1個，75%酒精棉球1瓶，100%酒精1瓶、培養(yǎng)皿5個，餐飲具衛(wèi)生（大腸菌群）檢測紙片專用恒溫培養(yǎng)箱1臺，光盤和說明書各1份。適用范圍：

餐飲具大腸菌群檢測紙片專用恒溫培養(yǎng)箱，適合于餐飲具大腸菌群檢測紙片培養(yǎng)使用，具有便攜、易操作等特點。儀器參數(shù)：額定電壓220V，額定頻率50HZ,額定功率25W，恒溫37～40℃，容量2L操作方法：1.將培養(yǎng)艙放在臺面上，兩只手掌壓住艙蓋，雙手手指（拇指除外）向上翻動艙蓋邊緣即可輕易打開艙蓋。2.將裝有檢測紙片的塑料袋放入培養(yǎng)艙內(nèi)，蓋好艙蓋，將培養(yǎng)艙放入培養(yǎng)箱中，蓋好箱蓋。3.接通電源，并按電源開關(guān)，液晶屏上顯示0：004.設(shè)定培養(yǎng)時間17小時，5.按啟動開關(guān)，屏幕顯示太陽圖標，培養(yǎng)開始倒計時，

17小時后培養(yǎng)結(jié)束（雪花圖標出現(xiàn)）。6.打開艙蓋，取出紙片觀察結(jié)果。38

用途：計數(shù)食品中的大腸菌群大腸埃希氏菌

原理：

1)存在于食品樣品中的大腸菌群特有的酶系統(tǒng)5-溴-4-氯-3吲哚-

-D吡喃半乳糖苷（放到培養(yǎng)基中）“

－D－半乳糖苷酶系統(tǒng)”5-溴-4-氯-3-吲哚氧化水不溶性藍色的二聚物

判定結(jié)果4．專有酶底物技術(shù)(ColiComplete)392）大腸埃希氏菌、志賀氏菌和一些沙門氏菌特有

4－甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷

“

—葡萄糖苷酶”4－甲基傘形酮波長UV光下(366nm)紫外光產(chǎn)生熒光

判定食品中是否有大腸菌群和大腸埃希氏菌40吖啶橙（acridineoringe,AO）染色計數(shù)法在國外已逐步作為細菌計數(shù)的一種標準方法，應(yīng)用于水、食品等領(lǐng)域。原理：AO能快速與脂質(zhì)結(jié)合，并能通過脂質(zhì)雙層膜，進入活細胞，在胞漿內(nèi)主要富集與溶酶體/以插入的方式和雙螺旋的DNA分子結(jié)合－激發(fā)后使活細胞顯黃綠色熒光。Baumgart用直接表面熒光濾膜技術(shù)快速檢驗肉末中的微生物，結(jié)果與標準平皿計數(shù)法檢驗結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.97。

3）染料活菌計數(shù)法

（1）吖啶橙染色計數(shù)法國外應(yīng)用：41（2）吖啶橙（AO）/溴化乙錠（EB）染色法吖啶橙染色后，使活細胞呈黃綠色熒光，而非活細胞

則成紅色或橙紅色；。

文字：

活細胞－－黃綠色熒光死細胞－－橙紅色熒光溴化乙錠僅能透過受損細胞膜，嵌入DNA，發(fā)橘紅色熒光（3）四哩鹽染色法（1）染料：四哩鹽是一種能接受氫原子的染料,化學(xué)名為3-（4,5-H甲基唆哩-2）-2,5-H苯基四氮哇澳鹽,商品名為鷹唆藍,簡稱My。原理：活細胞線粒體中的琉瑯酸脫氫酶能使外源性的MIT的四哩環(huán)還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物甲胞（Faan,而死細胞無此作用。用二甲基亞楓（DMSO）溶解此藍紫色結(jié)晶物,該溶液在一定波長下的光吸收值可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞濃度范圍內(nèi),光吸收值與活細胞數(shù)成正比。本法具有工作量小、操作簡便、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點,該方法已廣泛應(yīng)用于動物細胞的活細胞計數(shù)、生物因子的活性檢測、抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選、細胞毒性試驗等（魏鴻剛,李元廣,劉健微生物學(xué)通報）43（4）臺盼藍染法臺盼藍染法鑒別死活細胞的原理:死細胞的細胞膜無屏障作用，臺盼藍馬上進入細胞而顯藍色?；罴毎毎び羞x擇透性，對臺盼藍的透性小，進入細胞慢。經(jīng)臺盼藍染色后，可通過顯微鏡，直接鏡下計數(shù)或拍照后計數(shù)，實現(xiàn)對細胞存活率比較精確的定量分析。酵母大細胞比較適用。若染色時間過長，臺盼藍可能通過胞吞或胞飲作用進入活細胞不好區(qū)分死活細胞。第二法大腸桿菌VRB—MUG平板計數(shù)法第二法不適用于貝類產(chǎn)品

GBT4789.38-2008VRB—MUG瓊脂:結(jié)晶紫中性紅膽鹽-4-甲基傘形酮-D-葡萄糖醛酸苷瓊脂據(jù)反映該方法不是很好用，目的菌很少時尚可，多時難以計數(shù)分解的4-甲基傘形酮擴散后難以計數(shù)檢驗1.選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別取1mL注人兩個無菌平皿。另取1mL稀釋液注人一個無菌平皿中，作空白對照。2.將45℃±0.5℃的VRB瓊脂10mL～15mL傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣品勻液充分混勻。3.待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRB-MUG瓊脂覆蓋平板表層。凝固后翻轉(zhuǎn)平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。4.選擇菌落數(shù)為10～100的平板，暗室中360nm～366nm波長紫外燈照射下，計數(shù)平板上發(fā)淺藍色熒光的菌落。結(jié)晶紫中性紅膽鹽（violetredbile,VRB