腸道病毒71型及單純性皰疹病毒2型的抗病毒藥物的作用研究

腸道病毒71型及單純性皰疹病毒2型的抗病毒藥物的作用研究腸道病毒71型（Enterovirus71,EV71）是重癥或致死性手足口?。℉and,footandmouthdisease,HFMD）的主要病原體,能夠入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Centralnervoussystem,CNS）,造成永久性的損傷。目前,臨床上的主要治療方法為對(duì)癥治療及靜脈注射免疫球蛋白,尚無(wú)針對(duì)EV71感染可用的抗病毒藥物。因此,開(kāi)發(fā)安全有效的EV71的抗病毒藥物具有重要意義。Retro-2^cycl是通過(guò)細(xì)胞高通量篩選（High-throughputscreening,HTS）的方法得到的蛋白毒素抑制劑,對(duì)多種病原體的抑制活性相繼被報(bào)道。Retro-2^cycl通過(guò)靶向阻斷細(xì)胞囊泡運(yùn)輸（Intracellularvesicletransport）而對(duì)利用這一過(guò)程的病原體發(fā)揮抑制作用。細(xì)胞囊泡運(yùn)輸參與了EV71生命周期中包括非裂解性釋放（Non-lyticrelease）的數(shù)個(gè)重要過(guò)程,為Retro-2^cycl以及其活性衍生物Retro-2.1作為EV71潛在的抗病毒藥物的研究提供了可行性。因此,本論文對(duì)Retro-2^cycl及Retro-2.1對(duì)EV71的抗病毒作用進(jìn)行了研究。黃酮類(lèi)化合物（Flavonoids）是一類(lèi)具有相同母核的小分子化合物,有多種生物活性。其中,數(shù)種黃酮類(lèi)化合物對(duì)EV71的抗病毒活性已經(jīng)被相繼報(bào)道。然而,這些報(bào)道來(lái)自于不同研究體系,限制了化合物間橫向比較的可能性;此外,這些報(bào)道僅限于細(xì)胞水平的研究,而動(dòng)物模型的有效性是驗(yàn)證藥物發(fā)展?jié)摿Φ闹匾笜?biāo)。因此,本論文對(duì)代表性黃酮類(lèi)化合物對(duì)EV71的抗病毒活性進(jìn)行了研究。單純性皰疹病毒2型（Herpessimplexvirustype2,HSV-2）是引起生殖器皰疹的主要病原體,并具有終身潛伏性;HSV-2還能夠增加感染人類(lèi)免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）以及罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)。臨床上的主要治療方法為基于阿昔洛韋（Acyclovir）或其前藥的化學(xué)療法;然而,耐藥性以及嚴(yán)重的毒副作用限制了阿昔洛韋的使用。目前,在研的化合物多數(shù)由于毒副作用而被迫停止研究。因此,開(kāi)發(fā)安全有效的替代性HSV-2的抗病毒化合物迫在眉睫。ABMA是通過(guò)細(xì)胞高通量篩選（High-throughputscreening,HTS）的方法得到的另一類(lèi)蛋白毒素抑制劑,并對(duì)多種病原體具有抑制活性。ABMA通過(guò)靶向宿主細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)（Host-endosomaltrafficking）而發(fā)揮抑制作用,而細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)屬于細(xì)胞囊泡運(yùn)輸（Intracellularvesicletransport）的范疇,參與了HSV-2生命周期中包括內(nèi)吞進(jìn)入（Endocyticentry）及包膜包封（Envelopment）的數(shù)個(gè)重要過(guò)程,為ABMA作為HSV-2潛在的抗病毒藥物的研究提供了可行性。因此,本論文對(duì)ABMA對(duì)HSV-2的抗病毒作用進(jìn)行了研究。本研究分為以下三個(gè)部分:第一部分:Retro-2^cycl和Retro-2.1對(duì)EV71的抗病毒作用研究首先,我們建立了EV71的293S細(xì)胞感染模型,基于此模型通過(guò)細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathiceffect,CPE）及病毒空斑（Plaqueformation）效應(yīng)實(shí)驗(yàn),得到Retro-2^cycl和Retro-2.1的選擇性指數(shù)分別為:>39.81和5356。隨后,我們通過(guò)檢測(cè)不同的給藥方式對(duì)抑制活性的影響,發(fā)現(xiàn)Retro-2^cycl及Retro-2.1的有效作用階段為EV71生命周期的晚期階段,可能阻斷了子代病毒的包裝或釋放;在EV71子代病毒包裝及釋放階段（5–16h）給藥,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外病毒滴度降低,而細(xì)胞內(nèi)病毒滴度升高,證明Retro-2^cycl及Retro-2.1是通過(guò)阻斷子代病毒的釋放而發(fā)揮作用的;此外,還在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),Retro-2^cycl和Retro-2.1將EV71由細(xì)胞膜下的累積轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)中的均勻分布,直觀地驗(yàn)證了該抑制作用。最后,我們建立了EV71的BALB/c乳鼠致死感染模型,對(duì)Retro-2^cycl對(duì)EV71的體內(nèi)抗病毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià)(由于Retro-2.1的水溶性較低,僅對(duì)Retro-2^cycl進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn),提高Retro-2.1水溶性的優(yōu)化正在進(jìn)行中);發(fā)現(xiàn)Retro-2^cycl在10mg/kg的劑量下,能夠使致死劑量EV71感染的乳鼠的生存率提高至90%。綜上所述,該部分研究證明了Retro-2^cycl及Retro-2.1為EV71的體內(nèi)外有效制劑,并初步闡明了其作用機(jī)制:阻斷細(xì)胞囊泡運(yùn)輸參與的子代病毒的釋放;由于Retro-2^cycl的大量衍生物已經(jīng)被報(bào)道,該部分研究可為EV71抗病毒藥物的研究提供了先導(dǎo)化合物;由于Retro-2^cycl及Retro-2.1的作用靶點(diǎn)為細(xì)胞囊泡運(yùn)輸而非病毒本身,降低了產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn);由于Retro-2^cycl及Retro-2.1被報(bào)道對(duì)多種病原體均具有抑制作用,本部分研究進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大了病原體的范圍,為Retro-2^cycl及Retro-2.1發(fā)展為廣譜性藥物提供了依據(jù),并且提示:細(xì)胞囊泡運(yùn)輸可以作為有效的抗病毒靶點(diǎn)。第二部分:黃酮類(lèi)化合物對(duì)EV71的抗病毒作用研究首先,我們對(duì)9種黃酮類(lèi)化合物的體外活性進(jìn)行檢測(cè),為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的用藥劑量提供參考;結(jié)果顯示,9種化合物的選擇性指數(shù)均高于4;其中,7-羥基黃酮的治療指數(shù)為12215.79,具有最佳開(kāi)發(fā)潛力。隨后,我們選擇適宜的劑量對(duì)化合物的體內(nèi)抑制活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)9種化合物均對(duì)EV71的體內(nèi)感染具有顯著性的保護(hù)作用;其中,7-羥基黃酮在0.2mg/kg的低劑量下可達(dá)到66.67%的保護(hù)率,異鼠李素在10mg/kg的劑量下可達(dá)100%的保護(hù)率,具有最佳開(kāi)發(fā)潛力。綜上所述,該部分研究發(fā)現(xiàn)了異鼠李素對(duì)EV71的抗病毒作用;證明了9種黃酮類(lèi)化合物的體內(nèi)有效性;在同一體系中對(duì)9種黃酮類(lèi)化合物對(duì)EV71的抗病毒活性進(jìn)行研究,為化合物間的比較提供了依據(jù);證明了7-羥基黃酮及異鼠李素為具有較大抗EV71潛力的黃酮類(lèi)化合物。第三部分:ABMA對(duì)HSV-2的抗病毒作用研究首先,我們建立了HSV-2的Vero細(xì)胞感染模型,基于此模型通過(guò)細(xì)胞病變（Cytopathiceffect,CPE）及病毒空斑（Plaqueformation）效應(yīng)實(shí)驗(yàn),得到了ABMA的選擇性指數(shù)為:20.93;并通過(guò)基于病毒水平的核酸及蛋白含量檢測(cè)驗(yàn)證了其有效性。隨后,我們通過(guò)檢測(cè)不同的給藥方式對(duì)抑制活性的影響,發(fā)現(xiàn)ABMA對(duì)HSV-2的有效作用階段為生命周期的早期及晚期階段;通過(guò)病毒的吸附與進(jìn)入實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ABMA作用于HSV-2早期階段的進(jìn)入過(guò)程,并在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),ABMA將HSV-2由細(xì)胞核內(nèi)及核周分布轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞膜外分布,直觀地證明了該抑制作用;此外,通過(guò)在HSV-2晚期階段（6–18h）給藥,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外病毒滴度均顯著性地降低,而HSV-2的包裝及釋放發(fā)生在感染5h之后,是在晚期階段最有可能被抑制的過(guò)程。最后,我們建立了HSV-2的BALB/c雌鼠感染模型,對(duì)ABMA的體內(nèi)抗病毒效果進(jìn)行評(píng)價(jià),ABMA在5mg/kg的劑量下,使HSV-2生殖道攻毒后的小鼠存活率由8.33%提高至50%。綜上所述,該部分研究證明了ABMA為HSV-2的體內(nèi)外有效抑制劑,并初步闡明了其作用機(jī)制為: