腸道病毒71型及單純性皰疹病毒2型的抗病毒藥物的作用研究

腸道病毒71型及單純性皰疹病毒2型的抗病毒藥物的作用研究腸道病毒71型（Enterovirus71,EV71）是重癥或致死性手足口?。℉and,footandmouthdisease,HFMD）的主要病原體,能夠入侵中樞神經系統(tǒng)（Centralnervoussystem,CNS）,造成永久性的損傷。目前,臨床上的主要治療方法為對癥治療及靜脈注射免疫球蛋白,尚無針對EV71感染可用的抗病毒藥物。因此,開發(fā)安全有效的EV71的抗病毒藥物具有重要意義。Retro-2^cycl是通過細胞高通量篩選（High-throughputscreening,HTS）的方法得到的蛋白毒素抑制劑,對多種病原體的抑制活性相繼被報道。Retro-2^cycl通過靶向阻斷細胞囊泡運輸（Intracellularvesicletransport）而對利用這一過程的病原體發(fā)揮抑制作用。細胞囊泡運輸參與了EV71生命周期中包括非裂解性釋放（Non-lyticrelease）的數個重要過程,為Retro-2^cycl以及其活性衍生物Retro-2.1作為EV71潛在的抗病毒藥物的研究提供了可行性。因此,本論文對Retro-2^cycl及Retro-2.1對EV71的抗病毒作用進行了研究。黃酮類化合物（Flavonoids）是一類具有相同母核的小分子化合物,有多種生物活性。其中,數種黃酮類化合物對EV71的抗病毒活性已經被相繼報道。然而,這些報道來自于不同研究體系,限制了化合物間橫向比較的可能性;此外,這些報道僅限于細胞水平的研究,而動物模型的有效性是驗證藥物發(fā)展?jié)摿Φ闹匾笜?。因?本論文對代表性黃酮類化合物對EV71的抗病毒活性進行了研究。單純性皰疹病毒2型（Herpessimplexvirustype2,HSV-2）是引起生殖器皰疹的主要病原體,并具有終身潛伏性;HSV-2還能夠增加感染人類免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV）以及罹患宮頸癌的風險。臨床上的主要治療方法為基于阿昔洛韋（Acyclovir）或其前藥的化學療法;然而,耐藥性以及嚴重的毒副作用限制了阿昔洛韋的使用。目前,在研的化合物多數由于毒副作用而被迫停止研究。因此,開發(fā)安全有效的替代性HSV-2的抗病毒化合物迫在眉睫。ABMA是通過細胞高通量篩選（High-throughputscreening,HTS）的方法得到的另一類蛋白毒素抑制劑,并對多種病原體具有抑制活性。ABMA通過靶向宿主細胞內吞轉運（Host-endosomaltrafficking）而發(fā)揮抑制作用,而細胞內吞轉運屬于細胞囊泡運輸（Intracellularvesicletransport）的范疇,參與了HSV-2生命周期中包括內吞進入（Endocyticentry）及包膜包封（Envelopment）的數個重要過程,為ABMA作為HSV-2潛在的抗病毒藥物的研究提供了可行性。因此,本論文對ABMA對HSV-2的抗病毒作用進行了研究。本研究分為以下三個部分:第一部分:Retro-2^cycl和Retro-2.1對EV71的抗病毒作用研究首先,我們建立了EV71的293S細胞感染模型,基于此模型通過細胞病變效應（Cytopathiceffect,CPE）及病毒空斑（Plaqueformation）效應實驗,得到Retro-2^cycl和Retro-2.1的選擇性指數分別為:>39.81和5356。隨后,我們通過檢測不同的給藥方式對抑制活性的影響,發(fā)現Retro-2^cycl及Retro-2.1的有效作用階段為EV71生命周期的晚期階段,可能阻斷了子代病毒的包裝或釋放;在EV71子代病毒包裝及釋放階段（5–16h）給藥,發(fā)現細胞外病毒滴度降低,而細胞內病毒滴度升高,證明Retro-2^cycl及Retro-2.1是通過阻斷子代病毒的釋放而發(fā)揮作用的;此外,還在細胞免疫熒光實驗中發(fā)現,Retro-2^cycl和Retro-2.1將EV71由細胞膜下的累積轉變?yōu)榧毎|中的均勻分布,直觀地驗證了該抑制作用。最后,我們建立了EV71的BALB/c乳鼠致死感染模型,對Retro-2^cycl對EV71的體內抗病毒效果進行評價(由于Retro-2.1的水溶性較低,僅對Retro-2^cycl進行了體內實驗,提高Retro-2.1水溶性的優(yōu)化正在進行中);發(fā)現Retro-2^cycl在10mg/kg的劑量下,能夠使致死劑量EV71感染的乳鼠的生存率提高至90%。綜上所述,該部分研究證明了Retro-2^cycl及Retro-2.1為EV71的體內外有效制劑,并初步闡明了其作用機制:阻斷細胞囊泡運輸參與的子代病毒的釋放;由于Retro-2^cycl的大量衍生物已經被報道,該部分研究可為EV71抗病毒藥物的研究提供了先導化合物;由于Retro-2^cycl及Retro-2.1的作用靶點為細胞囊泡運輸而非病毒本身,降低了產生耐藥性的風險;由于Retro-2^cycl及Retro-2.1被報道對多種病原體均具有抑制作用,本部分研究進一步地擴大了病原體的范圍,為Retro-2^cycl及Retro-2.1發(fā)展為廣譜性藥物提供了依據,并且提示:細胞囊泡運輸可以作為有效的抗病毒靶點。第二部分:黃酮類化合物對EV71的抗病毒作用研究首先,我們對9種黃酮類化合物的體外活性進行檢測,為動物實驗的用藥劑量提供參考;結果顯示,9種化合物的選擇性指數均高于4;其中,7-羥基黃酮的治療指數為12215.79,具有最佳開發(fā)潛力。隨后,我們選擇適宜的劑量對化合物的體內抑制活性進行檢測,發(fā)現9種化合物均對EV71的體內感染具有顯著性的保護作用;其中,7-羥基黃酮在0.2mg/kg的低劑量下可達到66.67%的保護率,異鼠李素在10mg/kg的劑量下可達100%的保護率,具有最佳開發(fā)潛力。綜上所述,該部分研究發(fā)現了異鼠李素對EV71的抗病毒作用;證明了9種黃酮類化合物的體內有效性;在同一體系中對9種黃酮類化合物對EV71的抗病毒活性進行研究,為化合物間的比較提供了依據;證明了7-羥基黃酮及異鼠李素為具有較大抗EV71潛力的黃酮類化合物。第三部分:ABMA對HSV-2的抗病毒作用研究首先,我們建立了HSV-2的Vero細胞感染模型,基于此模型通過細胞病變（Cytopathiceffect,CPE）及病毒空斑（Plaqueformation）效應實驗,得到了ABMA的選擇性指數為:20.93;并通過基于病毒水平的核酸及蛋白含量檢測驗證了其有效性。隨后,我們通過檢測不同的給藥方式對抑制活性的影響,發(fā)現ABMA對HSV-2的有效作用階段為生命周期的早期及晚期階段;通過病毒的吸附與進入實驗,發(fā)現ABMA作用于HSV-2早期階段的進入過程,并在細胞免疫熒光實驗中發(fā)現,ABMA將HSV-2由細胞核內及核周分布轉變?yōu)榧毎ね夥植?直觀地證明了該抑制作用;此外,通過在HSV-2晚期階段（6–18h）給藥,發(fā)現細胞內外病毒滴度均顯著性地降低,而HSV-2的包裝及釋放發(fā)生在感染5h之后,是在晚期階段最有可能被抑制的過程。最后,我們建立了HSV-2的BALB/c雌鼠感染模型,對ABMA的體內抗病毒效果進行評價,ABMA在5mg/kg的劑量下,使HSV-2生殖道攻毒后的小鼠存活率由8.33%提高至50%。綜上所述,該部分研究證明了ABMA為HSV-2的體內外有效抑制劑,并初步闡明了其作用機制為: