細(xì)胞生物學(xué)常用技術(shù)

細(xì)胞生物學(xué)常用技術(shù)

2.應(yīng)用

(1)條件

可檢測(cè)、可攝入

(2)方法放射自顯影（autoradiography）

蛋白質(zhì)-aa

DNA-T

RNA-U

脈沖標(biāo)記A放射性物質(zhì)脈沖摻入活細(xì)胞B不同時(shí)間取樣切片C暗處曝光D顯影、定影胰島素合成分泌過程(二)抗體示蹤技術(shù)

1.抗體+熒光染料

光學(xué)顯微鏡GFP

GFP融合剪切體蛋白2.

抗體+電子致密物

電子顯微鏡

膠體金抗體標(biāo)記胰島素六、細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）特異性體外DNA擴(kuò)增技術(shù)

利用針對(duì)目的基因所設(shè)計(jì)的一對(duì)特異寡核苷酸引物，以目的基因?yàn)槟０?，以dNTP為原料，在DNA聚合酶作用下進(jìn)行的DNA體外合成技術(shù)。

（1）反應(yīng)體系：模板鏈

DNA聚合酶

dNTP

引物

（primer）（與模板相應(yīng)序列互補(bǔ)）

（2）反應(yīng)步驟：

變性94℃

退火55℃

延伸72℃

2.RealtimePCR

實(shí)時(shí)定量PCR(熒光定量PCR)通過對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。

熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量呈線性關(guān)系熒光背景信號(hào)階段平臺(tái)期以反應(yīng)管中熒光強(qiáng)度達(dá)到閾值時(shí)所需的PCR反應(yīng)循環(huán)個(gè)數(shù)（Cp值），表示模板中目的片段的初始含量。3.核酸分子雜交

(1)Southernblotting–DNA

將凝膠分離的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持膜上,然后與存在于液相中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交,以檢測(cè)特定DNA序列的技術(shù).

(2)Northernblotting

–

RNADNA

DNA

RNADNA

RNA

RNA特異性探針A基因組DNA的消化B瓊脂糖凝膠電泳分離C轉(zhuǎn)膜D雜交E放射自顯影(3)原位雜交技術(shù)（insituhybridization）

用核酸探針與細(xì)菌、細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，以檢測(cè)特定核酸分子在細(xì)胞內(nèi)原有位置的方法。FISH4.基因轉(zhuǎn)移技術(shù)應(yīng)用物理、化學(xué)或生物學(xué)等技術(shù)和方法將外源基因轉(zhuǎn)移到受體菌或細(xì)胞內(nèi)，并使其在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴(kuò)增或表達(dá)。

外源基因細(xì)菌轉(zhuǎn)化

真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因擴(kuò)增蛋白質(zhì)表達(dá)載體(1)限制性核酸內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶：識(shí)別DNA分子內(nèi)由4～8個(gè)堿基構(gòu)成的特定序列的酶，這些酶的識(shí)別位點(diǎn)大多是“回文”序列。粘性末端平滑末端(2)質(zhì)粒載體克隆(3)克隆基因的表達(dá)在細(xì)菌中的表達(dá)在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)5.抑制基因表達(dá)技術(shù)

研究基因功能及調(diào)控疾病的防治

RNA干擾技術(shù)

將與mRNA對(duì)應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，使mRNA發(fā)生特異性的降解，導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。起始階段：雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞siRNA(21-23)

（shortinterferingRNAs）效應(yīng)階段：

RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC解鏈結(jié)合mRNA

（RNAinducedsilencingcomplex）（降解）DicerATP基本原理6.免疫沉淀技術(shù)(immuno-precipitation,IP)是利用抗原和抗體的特異性結(jié)合以及細(xì)菌的ProteinA或G特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的Fc片段的現(xiàn)象而發(fā)展的可以研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。

研究蛋白質(zhì)相互作用

基本過程制備細(xì)胞裂解液

抗體-凝膠顆?；虼胖榉跤?xì)胞裂解液

沉淀目的蛋白及相互作用蛋白

分析SDSWesternblot

質(zhì)譜免疫沉淀過程7.染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)

(chromotinimmunoprecipitation,ChIP)研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的一種方法，即確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)基本過程甲醛處理細(xì)胞超聲破碎染色質(zhì)加入目的蛋白的抗體，形成抗體-靶蛋白-DNA復(fù)合物

沉淀復(fù)合物分析DNA片段-PCR染色質(zhì)交聯(lián)DNA超聲處理DNA/蛋白共沉淀交聯(lián)解除目的基因檢測(cè)七、質(zhì)譜技術(shù)

通過測(cè)定樣品（