金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)課件

金黃色葡萄球菌及其檢驗(yàn)

1、金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性

2、金黃色葡萄球菌的抗原構(gòu)造及分型簡(jiǎn)介3、金黃色葡萄球菌的致病性4、金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)5、金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法6、金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測(cè)7、金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法8、金黃色葡萄球菌污染的控制一、金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性1、形態(tài)與染色：(staphylococcusaureus)典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0.8μm左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無(wú)芽胞、鞭毛，大多數(shù)無(wú)莢膜。

革蘭氏染色陽(yáng)性。金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性2、培養(yǎng)特性：金黃色葡萄球菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度37°C，最適生長(zhǎng)pH7.4。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑1-2mm。血平板菌落周?chē)纬赏该鞯娜苎h(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10-15%NaCl肉湯中生長(zhǎng)。

金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性3、生化特性：可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽(yáng)性，VP反應(yīng)弱陽(yáng)性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對(duì)磺胺類(lèi)藥物敏感性低，但對(duì)青霉素、紅霉素等高度敏感。

二、金黃色葡萄球菌的抗原構(gòu)造和分型（簡(jiǎn)介）

對(duì)分型進(jìn)行簡(jiǎn)單的了解１、血清學(xué)分型：金葡水解，獲得兩種抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。蛋白抗原是凝集抗原，無(wú)特異性。多糖抗原有特異性。絕大多數(shù)金葡含有A型抗原，B型抗原主要存在于凝固酶陰性菌株，C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。２、噬菌體分型：３、根據(jù)腸毒素分型：４、根據(jù)血漿凝固酶分型：三、金黃色葡萄球菌的致病性

金黃色葡萄球菌是人類(lèi)化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。金黃色葡萄球菌的致病性金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：

a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；

b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；

c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)；

d.脫氧核糖核酸酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來(lái)作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；

e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E及F五種血清型。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。腸毒素可耐受100°C煮沸30分鐘而不被破壞,它引起的食物中毒癥狀是嘔吐和腹瀉。此外，金黃色葡萄球菌還產(chǎn)生溶表皮素、明膠酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有如下特點(diǎn)：季節(jié)分布，多見(jiàn)于春夏季；中毒食品種類(lèi)多，如奶、肉、蛋、魚(yú)及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報(bào)道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。一般說(shuō)，金黃色葡萄球菌可通過(guò)以下途徑污染食品：食品加工人員、炊事員或銷(xiāo)售人員帶菌，造成食品污染；食品在加工前本身帶菌，或在加工過(guò)程中受到了污染，產(chǎn)生了腸毒素，引起食物中毒；熟食制品包裝不嚴(yán)，運(yùn)輸過(guò)程受到污染；奶?；蓟撔匀橄傺谆蚯菪缶植炕摃r(shí)，對(duì)肉體其他部位的污染。

食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)

五、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法

1主題內(nèi)容與適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。2引用標(biāo)準(zhǔn)

GB4789.28-2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑3設(shè)備和材料(略)4培養(yǎng)基和試劑(略)5檢驗(yàn)程序(略)

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法

6操作步驟

6.1增菌培養(yǎng)法

6.1.1檢樣處理

稱(chēng)取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。

6.1.2增菌及分離培養(yǎng)

吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1℃溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培養(yǎng)24h，挑取金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。

6.1.3形態(tài)

本菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列是葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5～1μm。

6.1.4在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪陳大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周?chē)腥苎?。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周?chē)鸀橐换鞚釒?，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類(lèi)似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。

6.1.5血漿凝固酶試驗(yàn)

吸取1∶4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放36±1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。

6.2直接計(jì)數(shù)方法

6.2.1吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋?zhuān)鶕?jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊Baird－Parker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1℃溫箱培養(yǎng)。

6.2.2在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周?chē)谢鞚釒У暮谏洌闹腥芜x5個(gè)菌落，分別接種血平板，36±1℃24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。

6.2.3菌落計(jì)數(shù)：將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。

金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法用3mm接種環(huán),從有細(xì)菌生長(zhǎng)的各管中移取1環(huán),劃線接種于表面干燥的Baird-Parker瓊脂平板,置36±1℃培養(yǎng)45～48h。

怎樣在平板上進(jìn)行細(xì)菌的劃線分離。

1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法

金黃色葡萄球菌的單個(gè)菌落在Baird-Parker瓊脂平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤(rùn),直徑2～3mm?；液谏梁谏?有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周?chē)@以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣粘稠感。有時(shí)可見(jiàn)到不分解脂肪的菌株,除沒(méi)有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長(zhǎng)期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。金黃色葡萄球菌在BP平板上的菌落形態(tài)金黃色葡萄球菌血漿凝固酶按血漿凝固酶的機(jī)理不同可分兩種結(jié)合凝固酶：又稱(chēng)凝聚因子，是一種結(jié)合菌體細(xì)胞壁的酶，直接作用于血漿中的纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白而使葡萄球菌凝集成塊。于該酶存在菌體表面，故可用玻片法測(cè)之。分泌型凝固酶：是游離于菌體外的游離凝固酶，類(lèi)似凝血酶原樣物質(zhì)，不直接作用于血漿纖維蛋白原而是和一種凝固酶反應(yīng)因子結(jié)合形成一種穩(wěn)定復(fù)合物。該復(fù)合物具有凝血酶樣活性作用于纖維蛋白原而使血漿凝固。因此該酶只能用試管法檢測(cè)。金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)

取肉湯培養(yǎng)物0.3mL同0.5mL凝固酶試驗(yàn)兔血漿于8mm×100mm試管內(nèi)充分混合,置36±1℃培養(yǎng),定時(shí)觀察是否有凝塊形成,至少觀察6h,以?xún)?nèi)容物完全凝固,使試管倒置或傾斜時(shí)不流動(dòng)者為陽(yáng)性。試驗(yàn)中需同時(shí)做巳知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

七、金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)方法（簡(jiǎn)介）

目前，隨著研究的深入，一些快速和采用現(xiàn)代技術(shù)的檢測(cè)方法不斷出現(xiàn)，這些新的快速方法，一般都縮短了傳統(tǒng)檢測(cè)方法的時(shí)間，能夠較快地得到檢測(cè)結(jié)果，并且操作相對(duì)簡(jiǎn)單。比如：法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的RPF試劑盒、API檢測(cè)系統(tǒng)等。梅里埃公司生產(chǎn)的miniVIDAS利用熒光免疫的方法檢測(cè)葡萄球菌腸毒素，在儀器上45分鐘可以得到結(jié)果。附：梅里埃公司生產(chǎn)的miniVIDAS

比如：美國(guó)3M公司生產(chǎn)的金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)試片，可以直接計(jì)數(shù)產(chǎn)生耐熱核酸酶