生物化學(xué)蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)的構(gòu)造與功能第一章StructureandFunctionofProtein一、什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)經(jīng)過肽鍵(peptidebond)相連構(gòu)成的高分子含氮化合物。二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性1.蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分分布廣：一切器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機(jī)分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80％。1〕作為生物催化劑〔酶〕2〕代謝調(diào)理作用3〕免疫維護(hù)作用4〕物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲5〕運(yùn)動與支持作用6〕參與細(xì)胞間信息傳送2.蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能3.氧化供能蛋白質(zhì)的分子組成

TheMolecularComponentofProtein第一節(jié)組成蛋白質(zhì)的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘。各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只需測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)一、氨基酸——

組成蛋白質(zhì)的根本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸〔甘氨酸除外〕。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R非極性疏水性氨基酸極性中性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸〔一〕氨基酸的分類*20種氨基酸的英文稱號、縮寫符號及分類如下:甘氨酸glycineGlyG5.97丙氨酸alanineAlaA6.00纈氨酸valineValV5.96亮氨酸leucineLeuL5.98異亮氨酸isoleucineIleI6.02苯丙氨酸phenylalaninePheF5.48脯氨酸prolineProP6.30非極性疏水性氨基酸色氨酸t(yī)ryptophanTryW5.89絲氨酸serineSerS5.68酪氨酸t(yī)yrosineTryY5.66半胱氨酸cysteineCysC5.07蛋氨酸methionineMetM5.74天冬酰胺asparagineAsnN5.41谷氨酰胺glutamineGlnQ5.65蘇氨酸t(yī)hreonineThrT5.602.極性中性氨基酸天冬氨酸asparticacidAspD2.97谷氨酸glutamicacidGluE3.22賴氨酸lysineLysK9.74精氨酸arginineArgR10.76組氨酸histidineHisH7.593.酸性氨基酸4.堿性氨基酸特殊氨基酸脯氨酸〔亞氨基酸〕半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH〔二〕氨基酸的理化性質(zhì)1.兩性解離及等電點(diǎn)氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收二、肽*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而構(gòu)成的化學(xué)鍵?！惨弧畴?peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵*肽是由氨基酸經(jīng)過肽鍵縮合而構(gòu)成的化合物。*兩分子氨基酸縮合構(gòu)成二肽，三分子氨基酸縮合那么構(gòu)成三肽……*肽鏈中的氨基酸分子由于脫水縮合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連構(gòu)成的肽稱多肽(polypeptide)。N末端：多肽鏈中有自在氨基的一端C末端：多肽鏈中有自在羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵銜接而成的一種構(gòu)造。N末端C末端牛核糖核酸酶〔二〕生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH復(fù)原酶NADPH+H+NADP+三、蛋白質(zhì)的分類*根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分*根據(jù)蛋白質(zhì)外形纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

TheMolecularStructureofProtein第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子構(gòu)造包括

一級構(gòu)造(primarystructure)二級構(gòu)造(secondarystructure)三級構(gòu)造(tertiarystructure)四級構(gòu)造(quaternarystructure)高級構(gòu)造定義蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造指多肽鏈中氨基酸的陳列順序。一、蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。一級構(gòu)造是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的根底。二、蛋白質(zhì)的二級構(gòu)造蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的部分空間構(gòu)造，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。定義主要的化學(xué)鍵：氫鍵蛋白質(zhì)二級構(gòu)造的主要方式-螺旋(-helix)-折疊(-pleatedsheet)-轉(zhuǎn)角(-turn)無規(guī)卷曲(randomcoil)〔一〕-螺旋〔二〕-折疊〔三〕-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲是用來論述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈構(gòu)造?！菜摹衬ｓw在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級構(gòu)造的肽段，在空間上相互接近，構(gòu)成一個特殊的空間構(gòu)象，被稱為模體(motif)。鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體鋅指構(gòu)造三、蛋白質(zhì)的三級構(gòu)造疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學(xué)鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中一切原子在三維空間的排布位置?！惨弧扯x肌紅蛋白(Mb)N端C端纖連蛋白分子的構(gòu)造域〔二〕構(gòu)造域大分子蛋白質(zhì)的三級構(gòu)造?？煞指畛梢粋€或數(shù)個球狀或纖維狀的區(qū)域，折疊得較為嚴(yán)密，各行使其功能，稱為構(gòu)造域(domain)?！踩撤肿影閭H分子伴侶(chaperon)經(jīng)過提供一個維護(hù)環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或構(gòu)成四級構(gòu)造。*分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，如此反復(fù)進(jìn)展可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。*分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚后，再誘導(dǎo)其正確折疊。*分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確構(gòu)成起了重要的作用。亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質(zhì)的四級構(gòu)造蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的規(guī)劃和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級構(gòu)造。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完好的三級構(gòu)造，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。血紅蛋白的四級構(gòu)造蛋白質(zhì)構(gòu)造與功能的關(guān)系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)〔一〕一級構(gòu)造是空間構(gòu)象的根底一、蛋白質(zhì)一級構(gòu)造與功能的關(guān)系牛核糖核酸酶的一級構(gòu)造二硫鍵天然形狀，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊形狀，無活性牛核糖核酸酶〔二〕一級構(gòu)造與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)(谷氨酸〕HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)〔纈氨酸〕這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病〞。〔一〕肌紅蛋白與血紅蛋白的構(gòu)造二、蛋白質(zhì)空間構(gòu)造與功能的關(guān)系Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)〔稱百分飽和度〕隨O2濃度變化而改動?！捕逞t蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合才干的景象，稱為協(xié)同效應(yīng)。假設(shè)是促進(jìn)作用那么稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)假設(shè)是抑制造用那么稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)(negativecooperativity)變構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)蛋白質(zhì)空間構(gòu)造的改動伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)?！踩车鞍踪|(zhì)構(gòu)象改動與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病：假設(shè)蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，雖然其一級構(gòu)造不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改動，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改動導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常構(gòu)成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改動。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改動瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與分別純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein〔一〕蛋白質(zhì)的兩性電離一、理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。*蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)?！捕车鞍踪|(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的要素顆粒外表電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉〔三〕蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)要素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間構(gòu)造變成無序的空間構(gòu)造，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改動和生物活性的喪失。呵斥變性的要素如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等。變性的蛻變——破壞非共價(jià)鍵和二硫鍵，不改動蛋白質(zhì)的一級構(gòu)造。運(yùn)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性要素常被運(yùn)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白量變性也是有效保管蛋白質(zhì)制劑〔如疫苗等〕的必要條件。假設(shè)蛋白量變性程度較輕，去除變性要素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。天然形狀，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊形狀，無活性牛核糖核酸酶*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因此從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白量變性后的絮狀物加熱可變成比較鞏固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。二、蛋白質(zhì)的分別和純化〔一〕透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法運(yùn)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，到達(dá)濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的?！捕潮恋?、鹽析及免疫沉淀*運(yùn)用丙酮沉淀時，必需在0～4℃低溫下進(jìn)展，丙酮用量普通10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立刻分別。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等參與蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并構(gòu)成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分別獲得抗原蛋白?！踩畴娪镜鞍踪|(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極挪動。這種經(jīng)過蛋白質(zhì)在電場中泳動而到達(dá)分別各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。蛋白質(zhì)的電泳方法*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，經(jīng)過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差別而分別蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研討的重要技術(shù)?！菜摹硨游鰧游?chromatography)分別蛋白質(zhì)的原理待分別蛋白質(zhì)溶液〔流動相〕經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)〔固定相〕時，根據(jù)溶液中待分別的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分別的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而到達(dá)分別蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)分別常用的層析方法*離子交換層析