多克隆抗體的制備

多克隆抗體的制備器材：剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科手術鑷子（游離血管用）一把、直頭眼科手術剪（剪血管用）一把，手術刀架，手術刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑18cm）、彎頭止血鉗四把，直頭止血鉗兩把，手術縫合線，塑料放血管，紗布等。試劑：生理鹽水（或PBS），弗氏完全佐劑（Freund’scompleteadjuvant,FCA）SigmaF-5881，弗氏不完全佐劑（Freund’sincompleteadjuvant,FIA）SigmaF-5506，二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2%NaNq3兔子的選擇：兔子的重量應在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見耳靜、動脈，健康。4.Pre-bleeding：抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測抗體時作為陰性對照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時間，可以進行耳動脈取血。取血量約5ml足矣。免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量。抗原經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過程比較費時、費力，但若乳化不充分，會影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。免疫方法可采用背部多點注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，每點注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點注射（不要選擇臨近位點，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100Mg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。免疫一周后，可以耳動脈取血檢測抗體效價。因為起初幾次免疫產(chǎn)生的抗體的效價比較低，頭兩次取血，夠檢測用即可。在三次免疫后，可以獲得較高效價的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會造成兔子貧血。最后一次取血可以采用頸動脈放血，具體操作如下：家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚；沿頸部中線用手術刀切開皮膚約10cm，分離皮下結締組織，直至暴露出氣管兩側的胸鎖乳突?。ㄐ⌒牟僮?，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后用彎頭眼科鑷使之游離，剝離神經(jīng)和結締組織；于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住；用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科手術剪在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結扎固定于放血管上，以防放血管滑脫；松開止血鉗，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。5.血清的分離：如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN 3至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。兔采血法1.耳靜脈采血本法為最常用的取血法之一，常作多次反復取血用，因此，保護耳緣靜脈，防止發(fā)生栓塞特別重要。將兔放入僅露出頭部及兩耳的固定盒中，或由助手以手扶住。選耳靜脈清晰的耳朵，將耳靜脈部位的毛拔去，用75%酒精局部消毒，待干。用手指輕輕摩擦兔耳，使靜脈擴張，用連有5(1/2)號針頭的注射器在耳緣靜脈末端刺破血管待血液漏出取血或?qū)⑨橆^逆血流方向刺入耳緣靜脈取血，取血完畢用棉球壓迫止血，此種采血法一次最多可采血5-10ml。(2.耳中央動脈采血將兔置于兔固定筒內(nèi)，在兔耳的中央有一條較粗、顏色較鮮紅的中央動脈，用左手固定兔耳，右手取注射器，在中央動脈的末端，沿著動脈平行地向心方向刺入動脈，即可見動脈血進入針筒，取血完畢后注意止血。此法一次抽血可達15ml。但抽血時應注意，由于兔耳中央動脈容易發(fā)生痙攣性收縮，因此抽血前，必須先讓兔耳充分充血，當動脈擴張，未發(fā)生痙攣性收縮之前立即進行抽血，如果等待時間過長，動脈經(jīng)常會發(fā)生較長時間的痙攣性收縮。取血用的針頭一般用6號針頭，不要太細。針刺部位從中央動脈末端開始。不要在近耳根部取血，因耳根部軟組織厚，血管位置略深，易刺透血管造成皮下出血。心臟取血將家兔仰臥固定，在第三肋間胸骨左緣3毫米處注射針垂直刺入心臟，血液隨即進入針管。注意事項有：⑴動作宜迅速，以縮短在心臟內(nèi)的留針時間和防止血液凝固；⑵如針頭已進入心臟但抽不出血時，應將針頭稍微后退一點。⑶在胸腔內(nèi)針頭不應左右擺動以防止傷及心，肺、一次可取血20-25ml。后肢脛部皮下靜脈取血將兔仰臥固定于兔固定板上，或由一人將兔固定好。拔去脛部被毛，在脛部上端股部扎以橡皮管，則在脛部外側淺表皮下，可清楚見到皮下靜脈。用左手兩指固定好靜脈，右手取帶有5(1/2)號針頭的注射器內(nèi)皮下靜脈平行方向刺入血管，抽一下針栓，如血進入注射器，表示針頭已刺入血管，即可取血。一次可取2?5ml。取完后必須用棉球壓迫取血部位止血，時間要略長些，因此處不易止血。如止血不妥，可造成皮下血腫，影響連續(xù)多次取血。股靜脈、頸靜脈取血先作股靜脈和頸靜脈暴露分離手術⑴股靜脈取血注射器平行于血管，從股靜脈下端向心方向刺入，徐徐抽動針栓即可取血。抽血完畢后要注意止血。股靜脈較易止血，用于紗布輕壓取血部位即可。若連續(xù)多次取血，取血部位宜盡量選擇靠離心端。⑵外頸靜脈取血注射器由近心端(距頸靜脈分支2