微生物第七章1

第七章微生物的生長及其控制第一節(jié)微生物生長規(guī)律第二節(jié)影響微生物生長的環(huán)境要素第三節(jié)微生物生長的控制方法第一節(jié)微生物的生長規(guī)律7.1.1微生物的培育和群體生長7.1.2生物量測定方法7.1.3微生物的生長規(guī)律7.1.4生長參數(shù)和生長過程控制7.1.5維持穩(wěn)定生長的方法微生物的培育：在實驗室或在工業(yè)上，運用培育基和培育容器，在特定培育工藝和培育條件下，人工培育微生物，獲得微生物菌體或代謝產(chǎn)物的過程；在培育過程中，微生物的個體生長表現(xiàn)為細胞組分的平衡添加，細胞形狀略有增大；微生物的繁衍導致個體數(shù)量或生物量有規(guī)律的增長，表現(xiàn)為群體的生長；群體生長與培育條件〔培育基和環(huán)境要素〕親密相關；7.1.1微生物培育和群體生長在人工培育條件下培育微生物，經(jīng)過繁衍而得到的微生物群體稱為培育物〔culture〕；只需一種微生物的培育物，或者由單個細胞繁衍得到的微生物群體，稱為純培育物〔pureculture〕，簡稱純培育；微生物的實驗室培育和工業(yè)發(fā)酵，普通都是純培育；微生物由于個體微小，很容易混雜，需求經(jīng)常性的進展菌種純化，以獲得微生物的純培育；微生物的純培育平板單菌落分別法：使微生物的單細胞或單孢子充分分散，彼此分開，然后涂布在固體平面培育基上，培育后長出的單菌落，很能夠是由一個細胞或孢子繁衍構成的純培育；平板劃線法分別法稀釋涂〔倒〕平板法顯微支配器分別：借助顯微鏡和顯微操作工具，直接分別單細胞〔單孢子〕，然后接種培育；純培育的分別方法用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液或菌苔，在平板上劃線；每畫一組平行線，灼燒接種環(huán)一次；反復劃線、可拉出單細胞；平板劃線法分別法

稀釋涂〔倒〕平板法將待分別資料制備成懸液，使細胞或孢子充分分散；用10倍稀釋法稀釋，取適當濃度的稀釋液，涂布平板或與培育基混合后倒平板：涂平板加菌懸液0.2mL倒平板加菌懸液1mL微生物的培育方法根據(jù)培育基物理形狀和培育規(guī)模，好氧微生物培育方式分為：固體斜面培育、固體平板培育、茄子瓶培育、大規(guī)模固體發(fā)酵；半固體試管培育；搖管培育、搖瓶培育、小型發(fā)酵罐培育、大規(guī)模深層攪拌液體發(fā)酵；實驗室培育厭氧菌需求驅(qū)除和隔絕氧氣；工業(yè)厭氧液體發(fā)酵；在微生物生理代謝根底研討，或者微生物工程運用中，大多運用發(fā)酵罐〔生物反響器〕進展液體培育；分批培育〔batchculture〕：指恒定體積的液體培育，從接種開場，直到培育終了，在培育過程中不補充營養(yǎng)，也不移出培育物；流加分批培育：在培育過程中，不斷流加營養(yǎng)物，培育體積不斷添加；延續(xù)培育：在培育過程中，不斷流加營養(yǎng)物，同時不斷移出培育物；發(fā)酵罐微生物液體培育方式微生物工業(yè)發(fā)酵過程發(fā)酵工程包含三個過程：上游技術〔微生物遺傳育種技術〕、微生物發(fā)酵過程和下游技術〔分別工程〕；微生物發(fā)酵過程包含同時進展的微生物培育過程和微生物反響過程；在工業(yè)微生物發(fā)酵過程中，既要控制微生物的生長，又要控制微生物的代謝；通常的微生物培育僅需求控制微生物的生長；控制微生物生長，必需了解微生物的生長規(guī)律，清楚影響生長的主要要素；青霉素G的發(fā)酵消費工藝——發(fā)酵〔反響〕過程種子培育：產(chǎn)生強壯和大量的種子；產(chǎn)黃青霉接種到固體培育基上，在25℃下培育7天，收獲產(chǎn)黃青霉的孢子；將孢子洗脫下來，制備孢子懸液，接種到液體種子培育基中，在27℃下，種子罐通氣攪拌培育24h；發(fā)酵培育〔微生物反響〕：獲得大量次級代謝產(chǎn)物；將種子培育液接種到發(fā)酵罐中，在27℃下，通氣攪拌培育7天，期間流加苯乙酸，作為合成青霉素的前體物；種子擴展培育和發(fā)酵的工藝流程和工藝條件工業(yè)發(fā)酵：經(jīng)過控制微生物的培育條件，使微生物正常生長，并大量積累目的代謝產(chǎn)物；平面培育一級種子罐培育搖管培育搖瓶培育二級種子罐培育發(fā)酵培育7.1.2生物量測定方法微生物培育物的定量測定，稱為生物量測定；測定對象不同，方法不同，單位也不同，但可相互校正；顯微鏡直接計數(shù)法：測單細胞或單孢子；平板菌落計數(shù)法：測單細胞或單孢子；細胞濕重和干重法：測定單細胞或絲狀微生物；分光光度法：測單細胞或單孢子；生理目的法：測定單細胞或絲狀微生物；顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法：是在顯微鏡下，用血球計數(shù)板對單細胞或單孢子直接計數(shù)，單位為：個數(shù)/mL；顯微鏡直接計數(shù)法不能區(qū)分死菌與活菌，稱為全菌計數(shù)法；血球計數(shù)板是一塊特殊的載波片，在中間的兩個平臺上各刻有一個大方格網(wǎng)；大方格網(wǎng)由九個大方格組成，中間的正方形大方格為計數(shù)室；計數(shù)室邊長1mm、高0.1mm，體積0.1mm3〔10-4ml〕血球計數(shù)板的構造計數(shù)室平臺方格網(wǎng)方格網(wǎng)計數(shù)室被劃分為25個中方格，每個中方格分為16個小方格，共400個小方格；上面蓋上蓋玻片；血球計數(shù)板的運用方法濃度約108個細胞/毫升的菌懸液，滴加在蓋玻片與血球計數(shù)板平臺的結合處，使菌懸液經(jīng)毛細作用吸入計數(shù)室，靜置，使細胞沉底；計數(shù)假設干小格內(nèi)的細胞數(shù)，計算每小格平均數(shù)，那么：菌濃〔個/ml〕＝每格平均數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)將待測菌懸液適當稀釋后，涂布在平面培育基上，培育后進展菌落計數(shù)，一個菌落相當于一個活細胞；平板菌落計數(shù)屬于活菌計數(shù)法，適用于單細胞或單孢子計數(shù)，單位：菌落構成單位/mL〔cfu/mL〕〔colonyformingunit，cfu)平板菌落計數(shù)法選擇生長50～300個單菌落的平板進展計數(shù)，結果準確；平板菌落計數(shù)方法10倍稀釋法制備待測菌懸液，選擇適當?shù)南♂尪?，定量?.1~0.2mL〕取稀釋液涂布平板，或者定量〔1mL〕取稀釋液與融化后冷卻至45℃的培育基混合倒平板；培育后，對長出的單菌落計數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)，得到原菌液的生物量：cfu/mL通常選擇三個稀釋度涂平板，擇其適宜者計數(shù)；單細胞或絲狀微生物的生物量均可用直接丈量濕重或干重的方法丈量；離心搜集細胞沉淀，無菌水充分洗滌后，直接分析天平稱重—濕重〔mg/ml〕；洗滌后的細胞沉淀在105℃下烘干至恒重，分析天平稱重—干重〔mg/ml〕；培育液菌體濕重約40g/L，干重約4mg/mL；濕重受培育基成分影響大，而不準確；干重法費時，靈敏度低，適于測定絲狀微生物：細胞濕重和干重法在一定范圍內(nèi)，菌懸液的菌體濃度與一定波長下的光密度值〔opticaldensity,OD值〕呈線性關系；用分光光度計，在600nm波長下，測定菌懸液的OD600值，或吸光度值〔A600〕，可校正為1OD=n個細胞/mL；分光光度法OD值在0.2~0.8之間呈線性關系；適用于單細胞或單孢子懸液的生物量測定；在不方便運用顯微計數(shù)、平板菌落計數(shù)、細胞濕重和干重測定、分光光度測定生物量的情況下，可測定與生物量成比例關系的細胞總蛋白量，總核酸量，或者呼吸強度，間接測定總生物量，稱為生理目的法；測定總蛋白：凱氏定氮法測定測總核酸：定磷法測定測呼吸強度：CO2產(chǎn)生量〔速率〕生理目的法生長規(guī)律：二分裂殖的單細胞微生物在分批培育過程中，其生物量的增長隨培育時間的變化規(guī)律：即生長過程表現(xiàn)出延遲期、指數(shù)生長期〔對數(shù)期〕、穩(wěn)定期、對數(shù)衰亡期〔死亡期〕的規(guī)律變化；非二分裂殖或非單細胞的微生物在分批培育過程中，生長規(guī)律類似，但不典型；普統(tǒng)統(tǒng)過繪制微生物培育過程的生長曲線，反映其生長規(guī)律和生長參數(shù)；7.1.3微生物的生長規(guī)律微生物的生長曲線生長曲線：在分批培育中，以微生物的生物量為縱坐標，以培育時間為橫坐標繪制的曲線圖，反映生物量隨培育時間的變化；對于二分裂殖的單細胞微生物，用細胞數(shù)量的對數(shù)值為生長曲線的縱坐標；對于其它微生物可用培育液的OD值或者細胞干重作為縱坐標；在確定的液體培育條件下，接種后，每隔一定時間取樣，測定生物量，至培育終了；用生物量對培育時間作圖，得到某種微生物在特定條件下的生長曲線；生長曲線的繪制方法實線為活菌計數(shù)，虛線為總菌計數(shù)延遲期和指數(shù)生長期延遲期〔lagphase〕：培育的最初階段，生物量不隨培育時間添加；此階段，細胞繁衍速率很低，細胞處于吸收營養(yǎng)，調(diào)整代謝的生理階段；此階段，細胞繁衍速率最大且穩(wěn)定，細胞代謝旺盛生理形狀均一；對數(shù)期〔logphase〕或指數(shù)生長期〔exponentialgrowthphase〕：生物量隨培育時間呈指數(shù)曲線增長；穩(wěn)定期穩(wěn)定期〔stationaryphase〕：生物量堅持穩(wěn)定，不隨培育時間變化，此階段，細胞繁衍速率與死亡速率一樣，活細胞量處于動態(tài)平衡；生長到穩(wěn)定期，培育基中的營養(yǎng)物耗費、代謝廢物積累、環(huán)境條件改動；部分細胞開場衰老、死亡和自溶裂解，細胞形狀多樣、生理形狀不均一；衰亡期衰亡期或?qū)?shù)衰亡期〔logarithmicdeclinephase〕：活細胞數(shù)量隨培育時間呈指數(shù)曲線下降，細胞幾乎停頓繁衍，而死亡速率到達最大；此階段，營養(yǎng)物耗盡、有毒代謝物積累、環(huán)境惡化；多數(shù)細胞進入衰老、死亡和自溶形狀，細胞多畸形，活細胞數(shù)量降低；7.1.4生長參數(shù)和生長過程控制描畫生長過程的參數(shù)：延遲期的長短；指數(shù)期的代時和最大比生長速率；穩(wěn)定期的長短、最大生物量和生長得率；可經(jīng)過一定方式控制這些參數(shù)而控制生長過程；延遲期是休眠細胞的活化期，或者是細胞代謝系統(tǒng)與營養(yǎng)和環(huán)境條件的順應期；在工業(yè)發(fā)酵中有必要采取措施縮短延遲期，而縮短發(fā)酵周期：運用活化的新穎培育物作為菌種；運用營養(yǎng)豐富的天然培育基，或速效碳、氮源；使種子培育基與發(fā)酵培育基的營養(yǎng)物質(zhì)成分相近；增大接種量，縮短延遲期；延遲期長短的控制指數(shù)期是細胞以穩(wěn)定〔最大〕速率繁衍的階段，繁衍速率可用代時或倍增時間表征；代時〔generationtime，G〕：二分裂殖的單細胞微生物在指數(shù)期繁衍一代〔分裂一次〕所需求的時間；倍增時間〔doubletime，D〕：非二分裂殖或絲狀微生物在指數(shù)期生物量添加一倍所需時間；代時或倍增時間越短，闡明微生物的生長〔繁衍〕速率越快；代時或倍增時間與培育條件相關；指數(shù)期的代時或倍增時間(G)代時和倍增時間的測定方法二分裂殖單細胞微生物的生長曲線縱坐標上選擇指數(shù)期內(nèi)細胞數(shù)量為倍數(shù)關系的兩點，其對應橫坐標兩點之差為代時；非二分裂殖火絲狀微生物在生長曲線縱坐標上取生物量為倍數(shù)關系的兩點對應的時間差為倍增時間；N0：初始細胞量；Nt：t時間的細胞量;n：從0~t時間內(nèi)繁衍的代數(shù)二分裂殖單細胞微生物代時的計算公式G=————tt–t0tt–t0n=————————3.322(logNt－logN0)微生物在確定培育條件下的代時〔倍增時間〕Vibrionatriegens柱胞魚腥藻桃褐腐病菌巢狀組囊藻

比生長速率〔m〕：在確定培育條件下，在微生物指數(shù)生長期，單位生物量單位時間內(nèi)的添加量為常數(shù)，或細胞瞬時增長量與此時細胞量的比值是一個常數(shù)，表征各種微生物的生長速率：dN/dt＝mN〔m的單位：mg/mg·h＝h-〕lnNt-lnN0＝m(tt－t0)logNt-logN0＝m(tt－t0)/2.303μ＝(logNt－logN0)×2.303/(tt－t0)比生長速率〔m〕的計算∵G=〔tt-t0〕／3.322〔logNt－logN0〕m＝〔logNt－logN0〕×2.303/〔tt－t0〕∴G＝2.303／3.322mG＝0.693／m在指數(shù)生長期，比生長速率到達最大且穩(wěn)定；代時〔倍增時間〕最短且穩(wěn)定；某種微生物的比生長速率或代時，決議于生長的營養(yǎng)和環(huán)境條件，是可以控制的；代時或倍增時間與比生長速率的換算關系穩(wěn)定期繼續(xù)時間的延伸生長到達穩(wěn)定期后，營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低程度、有毒代謝廢物的積累量、環(huán)境惡化程度決議穩(wěn)定期的長短；在發(fā)酵工業(yè)中，消費次級代謝產(chǎn)物需求盡量延伸穩(wěn)定期，以便到達最高發(fā)酵單位；普通采用補充營養(yǎng)物，移出部分代謝產(chǎn)物的半延續(xù)或延續(xù)發(fā)酵方式，以及控制pH值，提高通氣量等方式延伸穩(wěn)定期；培育到穩(wěn)定期時到達了最大生物量，以濕重或干重g/L表征；影響最大生物量的主要要素是培育基中營養(yǎng)物的濃度；生物量〔g〕碳源耗費量〔g、mol〕Y＝穩(wěn)定期的最大生物量和生長得率生長得率〔Y〕：耗費單位量的營養(yǎng)物質(zhì)〔碳源〕所獲得的生物量；好氧菌普通Y值約為0.20～0.50；限制性營養(yǎng)物濃度與m和最大生物量的關系限制性營養(yǎng)物：生長必需的某種營養(yǎng)物〔碳源、氮源、生長〕在培育基中限量提供，也稱為生長限制性因子；限制性營養(yǎng)物濃度與最大生長量呈線性關系；與比生長速率呈雙曲線關系；在工業(yè)發(fā)酵消費中，或者