植物細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)課件

植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法種類及特點(diǎn)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一般操作過程

間接轉(zhuǎn)化法：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)法植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方法

DNA直接轉(zhuǎn)化法：基因槍法電擊法花粉管通道法化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法顯微注射法脂質(zhì)體法

間接轉(zhuǎn)化法是以生物體為媒介的植物轉(zhuǎn)基因方法,有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。

間接轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是以農(nóng)桿菌為媒介對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的方法。1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

它是通過根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒(Tumerinducingplasmid)和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒(Rootinducingplasmid)上的一段T-DNA區(qū)在農(nóng)桿菌侵染植物形成腫瘤的過程中,T-DNA可以被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞并插入到染色體基因中。

vir基因

Ti質(zhì)粒的vir區(qū)大小為30kb,分VirA、B、C、D、E、G、H等7個(gè)操縱子,一共有24個(gè)基因共同控制著T-DNA的加工和轉(zhuǎn)移,它們總稱調(diào)控子。葉盤消毒切取土壤農(nóng)桿菌浸泡篩選培養(yǎng)基愈傷組織分化幼苗優(yōu)點(diǎn)：

技術(shù)較成熟,轉(zhuǎn)化效率高操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器，培養(yǎng)周期短外源基因多以單拷貝或低拷貝插入受體細(xì)胞,穩(wěn)

定性好，減少了共抑制等基因沉默現(xiàn)象?？蓪⑤^大片段DNA完整地轉(zhuǎn)移到植物基因組中

等。缺點(diǎn)：主要轉(zhuǎn)化雙子葉植物。T-DNA可以在植物染色體的任何區(qū)域內(nèi)插入,有可能導(dǎo)致有益基因的插入失活。迄今所獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中80%以上是通過根癌農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化獲得的。病毒介導(dǎo)法是以病毒為媒介對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

的載體系統(tǒng)。具體來說就是將外源基因插入到病

毒基因組中,通過病毒對(duì)植物細(xì)胞的感染而將外源

基因?qū)胫参锛?xì)胞的一種植物轉(zhuǎn)基因方法。2.病毒介導(dǎo)法利用植物病毒介導(dǎo)法對(duì)植物基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化效

率比較高,但它的安全性受到質(zhì)疑,主要用于動(dòng)物

的基因轉(zhuǎn)移。

直接轉(zhuǎn)化法(又稱DNA直接導(dǎo)入法),它指不依賴于生物體將裸露的DNA直接轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞和原生質(zhì)體中,導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的技術(shù),與間接轉(zhuǎn)化法相比,直接轉(zhuǎn)化法不需構(gòu)建載體,因此又叫無載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。它適用于對(duì)農(nóng)桿菌侵染不敏感的植物,使用此法的前提是需要建立良好的細(xì)胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)及再生系統(tǒng)。DNA直接轉(zhuǎn)移法

DNA直接導(dǎo)入法最大的優(yōu)點(diǎn)是無需選擇宿主,可以導(dǎo)入生物細(xì)胞；缺點(diǎn)是嵌合基因整合進(jìn)宿主染色體的頻率低。該方法可以分為化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法、電穿孔法、脂質(zhì)體法、顯微注射法、基因槍法、離子束介導(dǎo)法和花粉管通道法?；驑尫姄舴ɑǚ酃芡ǖ婪ɑ瘜W(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法顯微注射法脂質(zhì)體法

基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出的。它通過高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，最后整合到植物基因組并得以表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過該法獲得的。

1.基因槍法DNA1.2

m鎢彈頭吸附特制手槍射擊植物裝入優(yōu)點(diǎn)：克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。缺點(diǎn)：進(jìn)去的DNA片段整合效率極低，遺傳穩(wěn)定性差，拷貝數(shù)多，不易獲得再生植株。

至今為止,該法已成為除了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法以外應(yīng)用最廣泛的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。此法已在葡萄、水稻等植物轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用,并獲得轉(zhuǎn)基因植株?；驑尫ㄒ部梢杂行У赜糜谌~綠體的轉(zhuǎn)化，還可以轉(zhuǎn)移RNA、DNA克隆等。

是在高壓電脈沖作用下在新鮮分離的原生質(zhì)體的質(zhì)膜上形成瞬時(shí)可逆性開放小孔,為外源DNA提供通道,借此導(dǎo)入DNA等遺傳物質(zhì),達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。由于質(zhì)膜具有可修復(fù)性,外加電壓造成的膜穿孔可在一定的時(shí)間內(nèi)自動(dòng)修復(fù),從而使細(xì)胞恢復(fù)到正常的生理狀況。2.電擊法植物細(xì)胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液1-2kV,3-25

F電擊愈傷組織幼苗分化優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，可以一次轉(zhuǎn)化許多原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化效率較高，特別適于瞬間表達(dá)。缺點(diǎn)：有原生質(zhì)體培養(yǎng)的麻煩,電穿孔易造成原生質(zhì)體損傷使再生率降低。

該法已在甘蔗、大麥小孢子、剪股穎等植物的基因轉(zhuǎn)化當(dāng)中。花粉管通道法是利用植物授粉后,所形成的天然花粉管通道,經(jīng)珠心通道,將外源DNA攜帶入胚囊,從而達(dá)到轉(zhuǎn)化目的的一種植物轉(zhuǎn)基因方法。3.花粉管通道法優(yōu)點(diǎn)：

適用范圍廣，不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株；

可直接獲得轉(zhuǎn)基因種子，育種時(shí)間短，在鑒定

時(shí)可直接針對(duì)目的性狀的表現(xiàn)型來進(jìn)行,簡(jiǎn)單快

捷；

轉(zhuǎn)化速度較快，變異性狀穩(wěn)定較快；

方法簡(jiǎn)單,不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化受體受植物花期的限制，同時(shí)必須充分了解

每一種植物的開花受精的時(shí)間過程。在自然田間進(jìn)行操作，受環(huán)境條件的影響很大。操作的經(jīng)驗(yàn)性很強(qiáng),需要一定的技巧。利用此方法獲得水稻、煙草、甘藍(lán)、小麥等植物的轉(zhuǎn)基因植株?；瘜W(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法是以原生質(zhì)體為受體,借助于特定的化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)DNA直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法。常用的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)有PEG(聚乙二醇)、PLO(多聚鳥氨酸)、PVA(聚乙烯醇)等,其中PEG法應(yīng)用較多,效果較好。PEG法是一種通過化學(xué)物質(zhì)PEG處理去壁的原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體,改變細(xì)胞膜的通透性使原生質(zhì)體獲得轉(zhuǎn)化的方法。4.化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)法優(yōu)點(diǎn)：PEG法操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果較穩(wěn)定、重復(fù)性

好、無需昂貴的基因轉(zhuǎn)化儀器，且嵌合轉(zhuǎn)化體很

少產(chǎn)生。

缺點(diǎn)：原生質(zhì)體培養(yǎng)再生難度較大；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化植株變異率高,易產(chǎn)生白

化苗，且由于PEG法對(duì)原生質(zhì)體活力有害，轉(zhuǎn)化

率低。應(yīng)用這種方法已成功的獲得大麥、柑桔、胡椒等植物的轉(zhuǎn)基因植株。顯微注射法是使用毛細(xì)微管(一般針尖的直徑為

0.5nm),在顯微鏡下將外源DNA注射入植物細(xì)胞

或原生質(zhì)體中的一種直接而完善的方法。5.顯微注射DNA該方法是Pena等1987年首創(chuàng)的,在用此方法進(jìn)行

基因?qū)霑r(shí),通常需要把原生質(zhì)體或培養(yǎng)的細(xì)胞固

定在瓊脂或低熔點(diǎn)的瓊脂糖上,或用聚賴氨酸處理

使原生質(zhì)體附著在玻璃平板上,也可以通過一固著的毛細(xì)管將原生質(zhì)體吸著在管口,再進(jìn)行操作。

優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高，特別是在沒有合適的DNA載體系統(tǒng)時(shí)

更有價(jià)值對(duì)轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒有限制，可選擇受體細(xì)胞的核的接

受位點(diǎn)受體不用特殊的選擇系統(tǒng)可以控制轉(zhuǎn)移的量和轉(zhuǎn)移物的濃度缺點(diǎn)：設(shè)備和技術(shù)的要求較高要想獲得轉(zhuǎn)化的植株,需要注射大量的細(xì)胞或原生質(zhì)體，費(fèi)時(shí)費(fèi)工對(duì)細(xì)胞有損傷，一次處理細(xì)胞數(shù)量不能太多，比較適合大細(xì)胞操作，主要用于動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)化中脂質(zhì)體是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能特性，人工用

脂類化合物合成的雙層膜囊。脂質(zhì)體法是Dellaporta等在1981年創(chuàng)造的,就是將

包含外源基因的脂質(zhì)體與植物原生質(zhì)體融合,從而

達(dá)到轉(zhuǎn)基因目的一種轉(zhuǎn)化方法。6.脂質(zhì)體法優(yōu)點(diǎn)：可避免DNA在導(dǎo)入受體細(xì)胞之前被核酸酶降解；適用的植物種類廣泛重復(fù)性高,包