天津醫(yī)科大學(xué)抗體純化與鑒定技術(shù)-09課件

抗體純化與鑒定技術(shù)臨床免疫學(xué)教研室李會強(qiáng)教授1抗體純化的目的去除：雜抗體（交叉反應(yīng)抗體）雜蛋白（提純IgG及其片段）2鹽析法粗提丙種球蛋白方法一:3實(shí)驗(yàn)原理：蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨鹽的濃度變化而變化。在低鹽濃度下溶解度隨鹽的濃度升高而增加，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定水平時，其溶解度又以不同程度下降并先后析出。4實(shí)驗(yàn)原理：蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有電荷的情況決定的。當(dāng)用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。5實(shí)驗(yàn)原理：同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。6操作：技術(shù)路線分離血清等倍稀釋50%飽和硫酸銨沉淀留沉淀33%飽和硫酸銨沉淀留沉淀9操作：注意事項(xiàng)硫酸銨的質(zhì)量飽和硫酸銨溶液配制蛋白質(zhì)濃度鹽析過程脫鹽10操作：透析除鹽11葡萄球菌蛋白A親和層析提取IgG方法二:12實(shí)驗(yàn)原理：蛋白A（ProteinA）或蛋白G（ProteinG）是細(xì)菌胞壁蛋白，它們能結(jié)合抗體Fc段。天然ProteinG具有3個IgG結(jié)合域，天然的ProteinA具有5個IgG結(jié)合域。這一結(jié)合非常牢固，但其親和力對pH的變化敏感，抗體/蛋白A或蛋白G的親和力隨pH的降低而急劇降低。13實(shí)驗(yàn)原理：對于哺乳動物IgG,ProteinA比ProteinG具有更大的親和力,尤其是對于IgG的一些亞類,包括人類的IgG3、小鼠的IgG1即達(dá)鼠的IgG2a.

14實(shí)驗(yàn)原理：15主要試劑：層析載體共價結(jié)合有蛋白A或蛋白G的樹脂瓊脂糖微球聚丙烯酰胺微球性質(zhì)穩(wěn)定，價格低廉16主要試劑：平衡緩沖液0.01Mol/LpH7.4PB洗脫緩沖液檸檬酸緩沖液pH=3檸檬酸緩沖液pH=617主要試劑：中和緩沖液氨基丁三醇-氯化鈉pH=3pH=618操作：裝柱平衡pH7.4PBpH3洗脫緩沖液pH8.9結(jié)合緩沖液pH6洗脫緩沖液pH3洗脫緩沖液19操作：20注意問題：21DEAE離子交換層析提取IgG方法三:22實(shí)驗(yàn)原理：DEAE-SephadexA-50陰離子交換樹脂能吸附陽離子；血清中的γ-球蛋白屬于中性蛋白，其余均屬酸性蛋白。在pH7.2～7.4的環(huán)境中,酸性蛋白被DEAE-SephadexA-50吸附，γ-球蛋白不被吸附而得以純化。23操作：裝柱平衡pH7.2PB上樣收集24操作：25抗體特異性純化方法四:26去除交叉反應(yīng)抗體，提高免疫血清特異性免疫親和層析是去除交叉反應(yīng)抗體最有效手段27純化抗體的鑒定方法四:28免疫血清鑒