免疫組化與細胞形態(tài)學研究課件

免疫組化與細胞形態(tài)學研究免疫組織細胞化學（理論10學時、實驗30學時）理論30分實驗70分出勤率10筆記10開卷考試10實驗表現(xiàn)20實驗結果30實驗報告20總成績100分參考書：主要內容第一節(jié)免疫組織化學的定義第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學第三節(jié)組織細胞的處理第四節(jié)免疫組織化學染色的原理和方法第五節(jié)免疫組織化學技術的實際應用組織學:體內結構為立體的，三維的，而課本、講義和顯微鏡下的結構均為平面的，二維的。a.

最常用的染料是蘇木素(Hematoxylin,H)和伊紅(Eosin,E)。*蘇木素是堿性染料，藍紫色，可以使細胞核等著色。被蘇木素著色的結構本身為酸性，具有嗜堿性(Basophilic)。石蠟切片

*伊紅是酸性染料，粉紅色?？梢詫⒋蠖鄶?shù)細胞的細胞質染成紅色。被伊紅著色的結構本身為堿性，具有嗜酸性(Acidophilic)。*不易被蘇木素和伊紅著色的結構具有嗜中性(Neutrophilic)。

肥大細胞的顆粒被甲苯銨藍(一種藍色染料)染成紫紅色b.

如果某結構顯示的顏色和染料本身的顏色不同，該結構具有異染性(Metachromasia)。c.

如果某結構能將銀離子還原成銀原子，并吸附銀原子而使自身顯示棕黑色，該結構具有嗜銀性(Argyrophilic)。

H&E染色的中等動靜脈d.

不同的染色方法，其結果不同。醛復紅染色的中等動靜脈網(wǎng)狀纖維具有嗜銀性，因此可以用銀鹽染色來顯示。

第一節(jié)免疫組織化學的定義

一、組織化學（Histochemistry）

是建立在組織和細胞內化學成分不同的基礎上，運用染色的方法區(qū)分出胞質、胞核和細胞外基質，從而顯示出組織和細胞的形態(tài)。第一節(jié)免疫組織化學的定義

通過生物化學的方法在原位產生不溶解的有顏色的反應產物，來顯示微細結構的位置，然后用顯微鏡觀察。

一、組織化學（Histochemistry）

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學，又不同于這些學科。第一節(jié)免疫組織化學的定義

一、組織化學（Histochemistry）組織學、細胞學：研究形態(tài)結構組織化學：化學組成含量，酶的存在及活性第一節(jié)免疫組織化學的定義

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學，又不同于這些學科。

一、組織化學（Histochemistry）第一節(jié)免疫組織化學的定義生物化學：破壞細胞，定位性差組織化學：原位顯示，定位性強

組織化學源于組織學、細胞學和生物化學，又不同于這些學科。

組織化學二、免疫組織化學（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學的定義免疫學免疫組織化學

立足于組織和細胞內的某些化學物質或結構成分能夠作為抗原，用相應的特異性抗體孵育組織切片，抗體與切片中的相應抗原特異性結合，形成抗原抗體復合物，在顯微鏡下觀察此復合物存在的位置和數(shù)量，確定出抗原在組織和細胞中的定位和定量。二、免疫組織化學（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學的定義

二、免疫組織化學（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學的定義抗原抗原抗體復合物鏡檢標記的特異性抗體

定義：免疫組織化學又稱免疫細胞化學。它是組織化學的分支，它是用標記的特異性抗體（或抗原）對組織內抗原（或抗體）的分布進行組織和細胞原位檢測的技術。二、免疫組織化學（Immunohistochemistry，ICC）第一節(jié)免疫組織化學的定義三、免疫組織化學的發(fā)展簡史第一節(jié)免疫組織化學的定義—1941年Coons

實用免疫熒光技術?！?0年代Nakane建立酶標抗體技術?！?981年Hsu建立了ABC法?！?0年代分子雜交、原位雜交、原位PCR法迅速發(fā)展—2000年各種免疫組化技術更加成熟，成為生命科學工作者必須掌握的基本技術之一。Acell-labelingtechniquecalledDiOlistics,inventedbypostdoctoralfellowsWen-BiaoGan,PhD,andJaimeGrutzendler,PhD,andfacultymembersRachelO.L.Wong,PhD,andJeffW.Lichtman,MD,PhD--distinguishesindividualcellsinthebrainusingsevendifferentcolors.

StylonychiamytilusAZM、UM、FCStylonychiamytilusParameciumcaudatumParameciumcaudatumStylonychiamytilus四、免疫組織化學的優(yōu)點及應用第一節(jié)免疫組織化學的定義1.特異性強2.靈敏度高3.定位準確優(yōu)點

組織細胞內具有抗原性的物質，如肽類、激素、神經(jīng)遞質、受體、表面抗原等均可用免疫組織化學方法顯示，在基礎與臨床科研中廣泛應用。四、免疫組織化學的優(yōu)點及應用第一節(jié)免疫組織化學的定義

第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學

一、抗原（antigen，Ag）第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學1.抗原的定義能夠刺激機體產生免疫反應的物質2.抗原的兩種特性:

①免疫原性

----能刺激機體產生相應的抗體

②免疫反應性----可與相應的抗體發(fā)生特異性結合

二、抗體（antibody，Ab）第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學1.抗體的定義：是機體在抗原物質刺激下形成的一類能與抗原特異性地結合的球蛋白，稱免疫球蛋白。

二、抗體（antibody，Ab）第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學2.抗體的標記：必要性：組織細胞內Ag—Ab結合反應一般是不可見的，若在鏡下檢測，必須具有可視性標記物。標記物：熒光素、酶、鐵蛋白、膠體金和放射性同位素等

2.抗體的標記：①熒光素標記：

在抗體上標記熒光素，經(jīng)特定波長的光照射激發(fā)后能夠發(fā)出熒光，借此定位觀察和追蹤。最常用：異硫氰酸熒光素

(FluoresceinIsothiocyanate,FITC)，紫外線激發(fā)下產生翠綠色熒光。

2.抗體的標記：②酶標記：

以酶作為標記物與外加的底物作用產生不溶性色素，沉積于抗原抗體反應的部位。常用：辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）

生物素2.抗體的標記：③生物素標記：生物素：又稱維生素H，一種小分子維生素抗生物素：又稱卵白素或親和素，對生物素具很強的結合力。兩者即可與抗體偶聯(lián)，又可被酶標記生物素抗生物素

生物素---抗生物素系統(tǒng)一端偶聯(lián)大分子生物反應體系，另一端連結標記物，后者加入酶的底物，產生顏色反應。

去除抗體溶液中不需要的雜有成分，提高標記抗體的特異性，減少背景染色。二、抗體（antibody，Ab）第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學3.標記抗體的純化：

4.標記抗體的質量評估和保存：

目前我們試驗所用的抗體大多由試劑公司（SIGMA、SANTA等）直接購買第三節(jié)組織細胞的處理第三節(jié)組織細胞的處理?標本制備恰當，是免疫組化成功的首要條件?免疫組化對組織和細胞標本的要求：–保持標本原有的結構、形態(tài)；–在原位保持待測抗原的免疫活性；–根據(jù)抗原含量及特性選擇最佳實驗方法。

一、取材二、固定三、脫水四、透明第三節(jié)組織細胞的處理五、透入與包埋六、切片七、貼片與烤片

免疫組化中常用的組織和細胞標本第三節(jié)組織細胞的處理?細胞標本組織印片細胞培養(yǎng)片細胞懸液涂片石蠟切片冰凍切片?組織標本一、取材

第三節(jié)組織細胞的處理一、取材將潔凈載玻片輕壓于已暴露的新鮮組織切面，細胞即粘附于玻片，晾干后固定，自然干燥后染片或-20℃保存。①組織印片（一）細胞標本的取材p53免疫組化結果,胃熱傷陰型,腺癌II級,+++,×100

第三節(jié)組織細胞的處理一、取材

貼壁細胞培養(yǎng)時，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細胞在蓋片上生長，達適當密度后取出固定，再染色。②細胞培養(yǎng)片（一）細胞標本的取材

第三節(jié)組織細胞的處理探討是否能夠從低溫保存的流產兒分離培養(yǎng)出脊髓神經(jīng)干細胞

第三節(jié)組織細胞的處理一、取材–手涂法

?將細胞直接涂于載玻片上，均勻不重疊。–涂片機涂片法

?將細胞樣品制成細胞懸液，加入涂片機內離心。③細胞懸液涂片（一）細胞標本的取材

第三節(jié)組織細胞的處理一、取材③細胞懸液涂片（一）細胞標本的取材海馬神經(jīng)元內11β-HSD1與GR的免疫細胞化學染色GC可以促進海馬神經(jīng)元11β-HSD1的表達,此作用是否與GR介導的基因機制有關糖皮質激素代謝酶11β-羥基類固醇脫氫酶Ⅰ型(11β-HSD1)和糖皮質激素受體(GR)在大鼠海馬神經(jīng)元內的共同分布及其意義。用免疫細胞化學方法研究顯示,海馬神經(jīng)元內不僅存在11β-HSD1免疫反應物質,還存在GR免疫反應物質,而且11β-HSD1與GR共存于同一個海馬神經(jīng)元內

第三節(jié)組織細胞的處理一、取材1.動物處死的要求：迅速處死，避免因痛苦產生組織細胞的變形2.動物處死的方法麻醉（乙醚、氯仿、4%戊巴比妥、20%氨基甲酸乙脂）擊頭、頸椎脫臼、毀腦和脊髓股動脈放血、空氣栓塞法（二）組織標本的取材

3.取材的注意事項（二）組織標本的取材1）處死后立即取材。2）刀片鋒利，維持原形。3）取材力求小而薄。4）詳細記錄材料名稱及取材時間。第三節(jié)組織細胞的處理一、取材

第三節(jié)組織細胞的處理二、固定（一）固定的目的1.終止酶的活性，防止自溶。2.維持原有形態(tài)。3.硬化組織，便于切片。

第三節(jié)組織細胞的處理二、固定（二）固定的注意事項1.取材后迅速固定2.選取適宜的固定劑3.固定液的用量（固定液：材料=20：1）4.固定的時間（取決于組織塊的大小、部位、固定液的滲透力及溫度）5.鉛筆做標簽（材料名稱、固定液及時間）

（三）理想的固定劑需具備的條件：1.迅速滲入材料。2.使細胞不致因固定引起人為的改變。3.對組織各部分滲透力相等，使組織內外完全固定。4.盡可能避免組織膨脹或收縮。5.增加細胞內含物的折光程度和染色能力。6.使組織變硬，適于切片，但又不至于太硬而松散。7.固定以后又有保存作用。

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：固定濃度：固定時間：固定后處理：配制方法：特性：滲透力強，組織收縮少。易氧化10%水溶液12-24h流水沖洗12-24h甲醛原液10-20ml+蒸餾水90-80ml1.甲醛

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：固定濃度：固定時間：固定后處理：配制方法：特性：兼有硬化和脫水作用。很少單獨使用。80--95%乙醇取決于組織大小及乙醇濃度4-12h直接入脫水劑無水乙醇80-90ml+蒸餾水10-20ml2.乙醇（酒精）

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：配制方法：固定時間：固定后處理：無水乙醇或95%乙醇（A）90ml+甲醛原液（F）10ml組織塊4-12h，鋪片5-10min直接入脫水劑脫水3.A-F液（乙醇-甲醛溶液）

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：配制方法：固定時間：固定后處理：飽和苦味酸75ml+40%甲醛25ml+冰乙酸5ml12-24h70%酒精洗去苦味酸的黃色4.Bouin液

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：配制方法：固定時間：固定后處理：冰乙酸10ml+氯仿30ml+無水乙醇60ml20-40min，較大材料不超過2-4h直接入脫水劑脫水5.Carony液

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：6.戊二醛-多聚甲醛緩沖液配制方法：固定后處理：應用：4%多聚甲醛磷酸緩沖液中加入0.5-1%戊二醛磷酸緩沖液水洗免疫電鏡

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：7.升汞固定濃度：固定時間：固定后處理：特性：5-7%水溶液不超過24h碘酒溶液脫汞劇毒

（四）常用固定劑的優(yōu)缺點：水溶液中性，淡黃色結晶固定蛋白質均勻，不使細胞收縮對胞質固定很好，而核則固定不好。優(yōu)點：穿透速度慢，可保持組織柔軟，防止硬化缺點：固定不均勻，表面過度以致于難于染色。深部沒有固定，僅中部才適宜。有毒。8.鋨酸（四氧化鋨）1-2%雙蒸水溶液

（五）固定的方法：1．浸入法：將組織浸在固定液內，必要時可在低溫（4℃）環(huán)境下進行，固定時間根據(jù)抗原的穩(wěn)定性以及固定液性質而定，一般2-12h之間。2．灌注法：適用于動物實驗研究。自左心室插入主動脈，先以生理鹽水沖冼血液后，注入固定液。置灌注動物于4℃冰箱內，次日取出腦組織或其它組織。外周組織一般在灌注后30min內取材，取組織置同一固定劑中浸入1-3h。

第三節(jié)組織細胞的處理三、脫水（一）脫水的目的

組織經(jīng)固定及水洗后含有大量水分，因水不能與石蠟混合，故需用脫水劑將組織中的水分置換出來。

第三節(jié)組織細胞的處理三、脫水（二）脫水劑類型常用：酒精、丙酮等。必須是與水在任何比例下都可混合的液體

第三節(jié)組織細胞的處理三、脫水（三）酒精脫水的注意事項1.逐級脫水（50%、70%、85%、95%、100%、100%）2.為徹底脫水走兩次純酒精3.70%酒精可長期保存材料4.脫水時間適宜。低濃度酒精中不宜過久，否則變軟，甚至促進分解。高濃度酒精中也不宜過久，否則收縮、變脆，切片困難。5.低溫脫水

第三節(jié)組織細胞的處理四、透明（一）透明的目的

共有兩次透明過程：

1.在浸蠟前、脫水后的透明過程。將脫水劑換成透明劑而有利于石蠟浸入。

2.切片染色后脫水再次透明。有利于封固劑的透入。使光線均勻透過切片，有利于觀察。

第三節(jié)組織細胞的處理四、透明（二）常用的透明劑1.二甲苯：最常用的透明劑，溶于酒精和石蠟。能與封固劑樹膠混合。透明力強，作用較快。

缺點：易使組織收縮變脆，此步不可久留，略帶酸性，略有褪色作用。

第三節(jié)組織細胞的處理四、透明（二）常用的透明劑二甲苯透明過程：100%酒精脫水后

1/2二甲苯+1/2純酒精

純二甲苯用二甲苯完全置換出酒精

第三節(jié)組織細胞的處理四、透明（二）常用的透明劑2.氯仿優(yōu)點：毒性低，材料收縮不太強烈，易揮發(fā)。缺點：能破壞染色。滲透力稍弱，需適當延長時間，比重大，易使材料漂浮第三節(jié)組織細胞的處理五、透入與包埋（一）透入的目的

除去組織中的透明劑而代之以石蠟，使石蠟滲入組織內部后把軟組織變?yōu)檫m當硬度的蠟塊，以便切成薄片。

第三節(jié)組織細胞的處理五、透入與包埋（二）透入包埋劑（石蠟）60~62℃時，用液態(tài)石蠟完全置換出二甲苯。室溫時石蠟凝固成固態(tài)，內含待切組織。

第三節(jié)組織細胞的處理五、透入與包埋（二）透入包埋劑（石蠟）室溫切片厚度3-5um5-8um8-10um10-15um石蠟熔點17-21℃60℃57℃54℃52℃22-24℃64℃60℃60℃57℃25-28℃67℃65℃62℃60℃（三）浸蠟與包埋過程中的注意事項石蠟太硬切片時容易破碎，不易切成蠟帶；石蠟太軟則使蠟帶皺縮，貼片時很難排平。2.新蠟使用前應先在浸蠟箱中融化，趕走氣泡，舊蠟可重復利用，效果比新蠟好。3.包埋時注意材料的方向性4.帶二甲苯的舊蠟統(tǒng)一回收，不帶二甲苯的舊蠟回收后再利用。5.不用燙鑷子夾材料，防止蠟帶帶靜電。6.做好標簽。第三節(jié)組織細胞的處理六、切片（一）切片機

第三節(jié)組織細胞的處理六、切片1.切片平整2.連續(xù)切片3.貼片牢固4.根據(jù)研究目的，調整切片厚度。

（二）切片的注意事項

1.蠟帶不直：修蠟塊時不平行2.不能切成連續(xù)蠟帶：切片刀不鋒利或刀口與蠟塊的角度不適合。3.蠟帶皺縮：石蠟太軟或切片時室溫過高，可用冷水浸蠟塊。切片太薄。刀口與蠟塊角度<15o4.蠟帶有靜電不成帶：包埋時溫度高燙了材料，不易糾正5.蠟帶翻上不成帶：石蠟硬，刀角不適當。6.盛蠟帶的紙盤一定要干凈。（三）切片時常見技術問題的處理

新載玻片清洗法：熱洗衣粉水洗自來水沖洗蒸餾水鹽酸酒精過夜自來水沖洗蒸餾水70%酒精擦凈裝盒備用第三節(jié)組織細胞的處理七、貼片與烤片（一）載玻片、蓋玻片的清洗鹽酸酒精的配制：95%酒精9份+濃鹽酸1份

舊載玻片清洗法：洗衣粉水煮沸20-30分鐘，攪動去掉蓋玻片，每片洗凈再按上述方法進行。第三節(jié)組織細胞的處理七、貼片與烤片（一）載玻片、蓋玻片的清洗

蓋玻片清洗法；逐片投入到95%酒精中浸泡過夜擦凈備用。

第三節(jié)組織細胞的處理七、貼片與烤片（二）常用的貼片劑APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸）鉻明膠溶液

石蠟組織切片中抗原性的修復

#抗原修復的原因

前期處理過程使蛋白大分子內或分子間發(fā)生交聯(lián)，從而屏蔽抗原決定簇或使其三維結構的構象發(fā)生改變。染色時需先進行抗原修復或暴露，將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。

石蠟組織切片中抗原性的修復

修復的方式：胰蛋白酶微波照射高壓加熱法水浴加熱法第四節(jié)免疫組化染色的原理及方法

按抗體標記物的性質分成：①免疫熒光法②免疫酶法③親合免疫組化等

免疫組織化學的技術分類

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法常用的標記熒光素：一、免疫熒光法熒光素激發(fā)光波長顏色FITC450-490nm翠綠色TRITC530-560nm紅色RB200570nm橙色

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法1.直接法

抗原+熒光素標記的第一抗體→熒光顯微鏡檢測簡單，特異性強，靈敏度低應用：基本不用了?。∫?、免疫熒光法抗原抗體熒光素

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法2.間接法

一、免疫熒光法抗原+第一抗體+熒光素標記的第二抗體→鏡檢2.間接法抗原2.間接法一抗抗原因信號被放大，因此更加敏感。應用：常用2.間接法一抗抗原熒光素標記的二抗

例：一、免疫熒光法

人催乳素兔注入產生兔抗人催乳素抗體（一抗）羊抗兔抗體（二抗）間接法的標記抗體適用范圍廣

熒光顯微鏡

熒光顯微鏡（倒置）激光掃描共聚焦顯微鏡

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法一、免疫熒光法直接法間接法

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法二、免疫酶法

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法原理：以酶作為標記物與外加底物作用產生不溶性的色素，沉積于抗原抗體反應部位。應用較廣二、免疫酶法

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法二、免疫酶法（一）酶標記抗體法（酶標法）

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法抗原+HRP酶標抗體→抗原-抗體-HRP復合物二、免疫酶法1.直接法（一）酶標記抗體法（酶標法）

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法抗原-抗體-HRP復合物+底物與顯色劑二、免疫酶法1.直接法（一）酶標記抗體法（酶標法）（

DAB-H2O2）DABHRP+H2O2HRP.H2O2HRP+D+H2O（有色）（供氫體）（底物）（酶）（酶-底物復合物）簡單，特異性強，靈敏度低，少用！

色第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法抗原+第一抗體+酶標第二抗體+(DAB-H2O2)二、免疫酶法2.間接法（常用）（一）酶標記抗體法（酶標法）

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法二、免疫酶法（二）非標記抗體酶法抗酶抗體酶HRP動物免疫產生

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法二、免疫酶法1.酶橋法（二）非標記抗體酶法抗酶抗體酶HRP動物免疫產生橋抗體

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法抗原+抗體+二抗(橋抗體)+抗酶抗體+HRP+(DAB-H2O2)二、免疫酶法1.酶橋法（三抗）（二）非標記抗體酶法

色→有色產物第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法抗原+抗體+二抗(橋抗體)+抗酶抗體+HRP+(DAB-H2O2)二、免疫酶法1.酶橋法（三抗）

抗體未經(jīng)酶標記三抗對抗原具有二次放大作用，比間接法敏感。（二）非標記抗體酶法

2.PAP法（酶-抗酶免疫復合物法）：

(Peroxidase-anti-peroxidasecomplex)

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法二、免疫酶法（二）非標記抗體酶法抗HRP抗體HRPPAP復合物PAP復合物穩(wěn)定，不易脫落，靈敏度高。

PAP法反應原理：抗原+一抗+二抗+PAP復合物+DAB-H2O2顯色液DAB-H2O2PAP復合物二抗

生物素第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法三、親合免疫組化生物素抗生物素（親合素、卵白素）兩者能和酶、抗體結合

生物素第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法三、親合免疫組化LAB法（標記抗生物素-生物素法）

(Labelledavidin-biotinmethod)用酶標記抗生物素

用生物素標記抗體LAB法反應原理：

抗原+一抗+生物素標記的二抗+酶標抗生物素+DAB-H2O2顯色液靈敏度高，特異性強，簡潔。DAB-H2O2

生物素第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法三、親合免疫組化BAB法（橋連抗生物素-生物素法）

(Bridgedavidin-biotinmethod)用酶標記生物素

用生物素標記抗體BAB法反應原理：

抗原+一抗+生物素標記的二抗+抗生物素+酶標生物素+DAB-H2O2顯色液

生物素第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法三、親合免疫組化ABC法（抗生物素-生物素-酶復合物法）

(Avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod)ABC復合物：生物素+酶+抗生物素生物素酶抗生物素ABC法反應原理：

抗原+一抗+生物素標記的二抗+ABC復合物+DAB-H2O2顯色液靈敏度高，特異性強，簡潔。ABC復合物DAB-H2O2

四、雙重或多重免疫組化

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法

在同一標本上同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原，光鏡下根據(jù)不同顏色判斷不同的抗原成分。1.雙重熒光染色2.雙重酶染色

五、非特異性著色

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法

染色過程中產生的非靶抗原的著色結果，屬假陽性，又稱背景著色。應盡量減少或消除。

六、對照的設置

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法1.陽性對照：用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行染色。對照片結果呈陽性。六、對照的設置

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法2.陰性對照：陰性標本對照：用確證不含已知抗原的標本作對照，結果呈陰性。六、對照的設置

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法2.陰性對照：空白對照：用緩沖液取代第一抗體進行試驗，結果為陰性。六、對照的設置

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法2.陰性對照：吸收試驗：特異性第一抗體用相應的純化抗原中和吸收，其結合位點全部被外源性抗原結合，不能再與組織內的靶抗原反應，用這種吸收后的第一抗體做免疫染色，結果為陰性。六、對照的設置

第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法2.陰性對照：抑制試驗：用未標記抗體與標記抗體先后與標本反應，未標記抗體起到封閉抗原的作用。染色結果減弱或轉陰。

3.染色實驗組與對照組結果分析表第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法陽性對照陰性對照替代對照實驗組結論1----操作錯誤2++++非特異性反應3+--+受檢組織含定位抗原4+---受檢組織不含定位抗原六、對照的設置

1.全部切片均為陰性的原因：①染色未完全嚴格按照操作步驟進行；②漏加一種抗體，或抗體失效；③底物中所加H2O2量少或失效；七、染色失敗的幾種原因第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法

七、染色失敗的幾種原因第四節(jié)免疫組織化學染色原理和方法2.全部切片均為陽性的原因：①染色過程中抗體過濃，或切片干燥了。②緩沖液洗滌不徹底。③使用已變色的顯色底物溶液，或顯色時間過長。④抗體孵育時間過長。⑤H2O2

濃度過高，呈色速度過快。

以石蠟切片為例寫出組織細胞處理的過程主要內容第一節(jié)免疫組織化學的定義第二節(jié)免疫組織化學中的免疫化學第三節(jié)組織細胞的處理第四節(jié)免疫組織化學染色的原理和方法第五節(jié)免疫組織化學的實際應用

第五節(jié)免疫組織化學的實際應用

第五節(jié)免疫組織化學的實際應用題目：家雞消化道內5-HT細胞的免疫組織化學定位

家雞消化道內5-HT細胞的免疫組織化學定位實驗目的

本實驗擬對家雞消化道5-HT細胞進行鑒定和定位研究。實驗材料：實驗方法：結果：討論：3.實驗方法3.1石蠟切片的制備3.1.1.取材：①用繩系于家雞頸部，窒息死亡。3.實驗方法3.1.1取材：②剖開體腔3.1.1.取材：

③取消化道各段：食管、嗉囊、腺胃、十二指腸、空回腸、盲腸和直腸。取材大?。?.5cm3.實驗方法3.1.2.固定：

用生理鹽水洗凈后，投入改良的Bouin’s液中固定12-24h過夜。3.實驗方法3.1.3.保存：

將固定液倒出，固定后的組織用70%酒精洗2次?？稍?0%酒精中暫時保存。3.實驗方法3.1.4.脫水：梯度酒精脫水80%乙醇3h90%乙醇3h95%乙醇I2h95%乙醇II2h無水乙醇I2h無水乙醇II2h

3.實驗方法3.1.5.透明：

1/2無水乙醇+1/2二甲苯2h（可過夜）二甲苯I2h

二甲苯II2h

3.實驗方法3.1.6.浸蠟：選取熔點為60℃的石蠟首先在60℃條件下熔解石蠟烘箱

3.實驗方法3.1.6.浸蠟：在60℃條件下進行1/2二甲苯+1/2石蠟2h純石蠟I2h純石蠟II2h

3.實驗方法3.1.7.包埋：將液體石蠟倒入包埋筐內，放入標簽，貼著筐壁，字向外，用酒精燈加熱鑷子，用鑷子攪動筐中央稍有些凝固的石蠟，將材料放入筐中央部位。室溫下凝固變硬成蠟塊

3.1.8.切片：把包埋好的蠟塊用刀片修切成正方形或長方形，注意勿太靠近組織，讓組織四周留有少許石蠟。蠟塊兩邊必須切成平行的直線，以免切下的蠟條彎曲。

3.1.8.切片：將上表面放有碎石蠟的手術刀在酒精燈上加熱。將熔好的蠟液涂在木塊上表面。再次加熱刀片，將刀片放于木塊與蠟塊之間，使蠟塊下表面及木塊上表面的蠟熔化后，迅速抽出刀片，蠟塊即粘于木塊上。用加熱的刀片將蠟塊與木塊接觸的四個邊緣稍熔，用手指按壓以加固。

3.1.8.切片：

將刀和木塊固定在切片機上。調整刻度指針到要求的厚度，一般要求5—8微米。切片刀要拭凈。用右手搖切片機轉輪，左手持毛筆托住蠟帶。勻速轉動轉輪。均勻切片。切好的蠟帶，放在切片盒內（或紙上）。

用刀片將其每4-5片分成一段。用無水乙醇將展片臺擦凈，使溫度保持在比包埋石蠟的熔點低5-6℃，如包埋石蠟的熔點為60℃，則展片臺宜在55℃左右。溫度過低，展片費時過長；溫度過高，石蠟熔化。切好的蠟帶切片盒3.1.9.貼片、展片：在預先用明膠處理過的載玻片一端滴二滴經(jīng)煮沸去氣泡的蒸餾水。用小鑷子夾取一段蠟帶，使浮在玻片的水上，擺正位置（一般稍偏于玻片的一端，留下貼標簽位置）。然后把玻片放在展片臺上，蠟帶受熱即自動展開，也可用解剖針輕輕拉開。傾斜載片，用吸水紙吸去多余水分。注意切片和載玻片之間不能有氣泡，否則在展片時氣泡會擴大，影響以后鏡檢。

3.1.9.貼片、展片：標簽37℃展片臺上烘片24h以上將片子移入載片盒，放入37℃恒溫箱內24h。處理好的片子放入4℃冰箱中備用。可保存1-2個月

3.1.9.貼片、展片：標簽

標簽標簽

3.2免疫組織化學染色：

3.2.1.脫蠟、復水：二甲苯I二甲苯II1/2二甲苯+1/2無水乙醇無水乙醇I無水乙醇II95%乙醇I95%乙醇II90%乙醇80%乙醇70%乙醇雙蒸水I雙蒸水II3.2免疫組織化學染色：每級各3~5min

每級各3~5min。二甲苯I

二甲苯II

1/2二甲苯+1/2無水乙醇無水乙醇I無水乙醇II95%乙醇I95%乙醇II90%乙醇80%乙醇70%乙醇雙蒸水I雙蒸水II3.2.1.脫蠟、復水：

3.2.2.用蠟筆在載片上畫蠟圈3.2免疫組織化學染色：標簽

3.2.3.加3%H2O2溶液37℃孵育15min，消除內源性過氧化物酶的活性。標簽3.2免疫組織化學染色：

3.2.4.雙蒸餾水浸洗5min，PBS浸洗5min。雙蒸餾水PBS3.2免疫組織化學染色：

以下步驟均在濕盒中進行：3.2.5.從PBS中取出切片，用濾紙吸去多余水分后，滴加正常羊血清（3：200），放入孵育濕盒內，室溫孵育20min。標簽3.2免疫組織化學染色：

3.2.6.棄去多余血清，滴加1：100稀釋的第一抗體，放入孵育濕盒內，室溫過夜。標簽3.2免疫組織化學染色：

PBS3.2.7.PBS沖洗3次，每次5min。3.2免疫組織化學染色：

3.2.8.滴加1：200生物素化二抗，放入孵育濕盒內，室溫孵育45min標簽3.2免疫組織化學染色：

PBS3.2.9.PBS沖洗3次，每次5min。3.2免疫組織化學染色：

3.2.10.用前30min，按一定比例混合A液（親和素）和B液（酶標生物素）形成親和素—生物素亞飽合復合物（稀釋倍數(shù)1：1：100），室溫孵育40min。標簽3.2免疫組織化學染色：

PBS3.2.11.PBS沖洗3次，每次5min。其間配制DAB-H2O2顯色液（2.5mlDAB，加1μlH2O2）3.2免疫組織化學染色：

3.2.12.DAB-H2O2顯色，冷蒸餾水沖洗、PBS沖洗，自來水洗凈。顯色應注意溫度與時間的關系，室溫宜5分鐘。染色稍淺亦可拿出，脫水，封片后顏色可加深。標簽3.2免疫組織化學染色：

3.2.13.用蘇木精復染標簽3.2免疫組織化學染色：

3.2.14.脫水、透明70%乙醇80%乙醇90%乙醇100%乙醇I100%乙醇II二甲苯I二甲苯II每級1min3.2免疫組織化學染色：

3.2.15.封片：加中性樹膠封片3.2免疫組織化學染色：

第一抗體由PBS取代同步進行以上實驗。3.3對照設置：2.實驗材料成體家雞2.1實驗動物

2.2主要試劑2.實驗材料一抗：5-HT抗體北京中山生物技術有限公司VECTASTAINABC免疫組織化學試劑盒：包括正常血清、試劑A、試劑B和二抗，由美國ZYMED公司生產。

氯化鈉、苦味酸、甲醛（36%）、乙醇、二甲苯、石蠟、硫酸鉻鉀、明膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、Tris、30%過氧化氫、3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）、鹽酸、氫氧化鈉,蘇木精，高錳酸鉀，鉀礬。2.3其它試劑2.實驗材料

LEICA組織切片機展片臺電熱恒溫培養(yǎng)箱、冰箱電子天平酸度計移液器LEICA顯微鏡2.4儀器設備2.實驗材料

2.5試劑配制與用具準備2.實驗材料①改良的Bouin,s固定劑的配制苦味酸飽和水溶液75ml

福爾馬林（36%甲醛）25ml

②粘片劑：鉻礬明膠液鉻礬（硫酸鉻鉀）0.5g

明膠5g

蒸餾水1000ml2.5試劑配制與用具準備2.實驗材料

在1000ml的燒杯中，加入500-800