探索線粒體DNA點(diǎn)突變與錳中毒性帕金森綜合癥的相關(guān)性

錳(Manganese，Mn)是一種重要的工業(yè)污染物，職業(yè)工人長期接觸錳所引起的慢性蓄積性中毒，其典型臨床表現(xiàn)、病理及神經(jīng)生化都酷似神經(jīng)退行性疾病——帕金森病，表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)錐體外系受損和震顫麻痹癥狀，我們稱之為錳中毒性帕金森綜合征。錳的神經(jīng)毒作用機(jī)制目前，錳中毒作用機(jī)制已從自由基介導(dǎo)的神經(jīng)毒性、線粒體損傷、巰基耗竭、能量代謝、多巴胺自氧化、興奮性毒性、鐵代謝等方面進(jìn)行了大量的研究，但至今仍未完全闡明。尤其是為何中毒癥狀在脫離錳接觸后仍會(huì)進(jìn)行性加重，其原因未能得到較好的解釋。此外，錳職業(yè)接觸人群在相同劑量和時(shí)間的作業(yè)環(huán)境暴露下，錳中毒者只占很少比例(<5％)，錳中毒的個(gè)體差異及敏感人群的存在，表明遺傳易感性可能在錳中毒發(fā)病過程中起重要作用。研究表明，錳蓄積可產(chǎn)生大量自由基，使得mtDNA更加容易受到攻擊而發(fā)生突變。同時(shí)，錳本身亦可降低mtDNA穩(wěn)定性。因此，我們推測(cè)mtDNA突變有可能是慢性錳中毒繼發(fā)帕金森綜合征發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象實(shí)驗(yàn)組(錳中毒)：錳中毒性帕金森綜合征患者28例，2010~2012年由廣西職業(yè)病診斷組集體診斷，符合我國慢性職業(yè)性錳中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)(GBZ3-2006)。其中男性24例，女性4例。漢族21例，壯族7例。病例平均年齡42.83±8.25歲，平均錳接觸業(yè)工齡18.00±6.91年。對(duì)照組一(錳接觸)：錳接觸患者30例，與錳中毒患者來自同車間的工人，相同工種和性別，其年齡和接觸錳的工齡也與病例組相近，每年的體檢均未發(fā)現(xiàn)錳中毒。調(diào)查時(shí)的體格檢查亦未發(fā)現(xiàn)有錳中毒的癥狀和體征。其中男性26例，女性4例。漢族26例，壯族4例。病例平均年齡41.20±9.33歲，平均錳接觸業(yè)工齡20.43±7.28年。對(duì)照組二(健康人)：30例為無錳接觸史、無帕金森綜合征、無遺傳病史的健康人群。其中男性19例，女性11例，漢族24例，壯族6例。病例平均年齡43.26±8.12歲。測(cè)序結(jié)果圖1：突變位點(diǎn)圖：A:7028突變位點(diǎn)為TB:7028位點(diǎn)原堿基C測(cè)序結(jié)果圖2：

A:8281～8289位點(diǎn)缺失后B:8281～8289位點(diǎn)缺失前

經(jīng)NCBI基因網(wǎng)站BLAST比對(duì)，如紅色圈圈所示，上圖為突變比對(duì)圖，下圖為缺失比對(duì)圖錳中毒組、錳接觸組及健康組mtDNA的COX三個(gè)亞基突變位點(diǎn)及突變?nèi)藬?shù)：表2-1：COX3個(gè)亞基突變位點(diǎn)和各實(shí)驗(yàn)組突變例數(shù)突變位點(diǎn)錳中毒組（例）錳接觸組（例）健康組（例）

▲6216（C＞T）001▲6413（C＞T）010▲6492（C＞T）010▲6575（G＞A）0107028（C＞T）8007106(G＞A)210▲7853（A＞G）1008056（C＞A)122▲8119（T＞C）1009bp缺失8658344（A＞C)7229540（T＞C）200▲9548（A＞G）100注：▲為發(fā)生例數(shù)太少，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

對(duì)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，各組間基因型頻率、突變基因分布的差異性的比較采用X2檢驗(yàn)分析。在錳中毒組、錳接觸組、健康組三組88例研究對(duì)象中發(fā)現(xiàn)mtDNA8281～8289(ccccctcta)9bp片段缺失及8119T＞C、8344A＞C、9540T＞C點(diǎn)突變率組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；9540T＞C、8119T＞C和7106G＞A，僅在錳組中發(fā)現(xiàn)，但例數(shù)較少，7106G＞A例數(shù)雖稍多但經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；

錳中毒組與錳接觸組、健康組7028C＞T點(diǎn)突變率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

為求證錳蓄積對(duì)線粒體有無危害，將錳中毒組和錳接觸組合并成有錳工作史者組（簡(jiǎn)稱錳組），并與健康人組（無錳工作史組，簡(jiǎn)稱無錳組）做對(duì)比。

分組研究例數(shù)（例）累計(jì)點(diǎn)突變個(gè)數(shù)（例）錳組5852無錳組3010合計(jì)8862

用行×列表X2檢驗(yàn)，得：X2=16.521，P=0.000，按α＝0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為錳組與無錳組突變總體構(gòu)成比不同。討論錳中毒是一種環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因子，盛行于采礦、焊接及鋼鐵制造等行業(yè)，職業(yè)工人長期接觸錳所引起的慢性蓄積性中毒，患者早期會(huì)出現(xiàn)如頭痛、乏力、失眠、精神萎靡等神經(jīng)衰弱和自主神經(jīng)功能障礙，進(jìn)一步進(jìn)展，會(huì)產(chǎn)生肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫等類似帕金森病的運(yùn)動(dòng)和癡呆、精神等癥狀。一旦進(jìn)展為錳中毒，患者就算脫離錳環(huán)境，錳中毒癥狀也會(huì)持續(xù)進(jìn)展，臨床上對(duì)于錳中毒治療主要以金屬絡(luò)合劑驅(qū)錳、多巴胺替代療法為主，只能在一定程度上臨床上控制癥狀和延緩病情發(fā)展，患者病程遷延，最終喪失勞動(dòng)能力，給患者家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。線粒體細(xì)胞色素氧化酶（COX）是線粒體呼吸鏈的終端酶,是唯一能將電子傳給氧分子的氧化酶電子傳遞鏈被阻斷COX亞基的受損電子泄漏氧自由基的生成增加能量合成減少或者受阻線粒體損傷細(xì)胞變性、死亡COX氨基酸的改變和全酶裝配錯(cuò)誤帕金森病、糖尿病、阿爾茨海默病等錳與線粒體線粒體細(xì)胞色素氧化酶（COX）錳線粒體COX突變損傷線粒體導(dǎo)致細(xì)胞凋亡黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡線粒體能量代謝障礙線粒體自由基攻擊和氧化損傷錳錳中毒性帕金森綜合癥細(xì)胞凋亡討論我們?cè)?8例研究對(duì)象中發(fā)現(xiàn)19例（21.6%）存在mtRDNA8281-8289(ccccctcta)9bp序列缺失，三組研究對(duì)象中該片段缺失率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。這是人類線粒體基因組COXⅡ和tRNALys基因間的一小段非編碼序,這種9bp缺失起先被認(rèn)為是亞洲人起源的人群所特有的。近年來的研究表明,它具有多重起源性,不同人種群9bp缺失頻率及分布不同使其成為研究人種遺傳分化的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到廣西人群該片段缺失率為21.6%，略高于之前國內(nèi)報(bào)道的平均水平17.2%。討論雖然發(fā)現(xiàn)7106G＞A、7853A＞G、8119T＞C、9540T＞C、9548A＞G點(diǎn)突變只在錳中毒組中出現(xiàn)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)的突變例數(shù)太少，這需要做進(jìn)一步的研究，這也可能是影響錳中毒帕金森綜合征的一個(gè)因素。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)錳中毒組7028C＞T位點(diǎn)突變率與錳接觸組、正常組的突變率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），我們推測(cè)mtDNA突變有可能是錳中毒性帕金森綜合征發(fā)病機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。錳中毒可能存在人群易感性錳職業(yè)接觸人群在相同劑量和時(shí)間的作業(yè)環(huán)境暴露下，僅有<5％的工人出現(xiàn)錳中毒，我們推測(cè)個(gè)體對(duì)錳易感性可能存在著差