園藝植物栽培課件組織培養(yǎng)技術(shù)

脫分化細(xì)胞器官成熟細(xì)胞再分化胚狀體愈傷組織4愈傷組織的形成和植株再生

植物的再分化形式有兩種，器官發(fā)生型和胚胎發(fā)生型，在有些情況下，再分化可以直接發(fā)生于脫分化的細(xì)胞中，無須經(jīng)歷愈傷組織階段，但大多數(shù)情況下，再分化過程是在愈傷組織細(xì)胞中發(fā)生的。麻瘋樹插條產(chǎn)生愈傷組織由菊花葉片的愈傷組織分化出的小植株4.1.1愈傷組織形成的條件4.1

愈傷組織的形成離體:與植株分離，從其它組織與器官的抑制中解脫出來。合適的培養(yǎng)條件：大量研究表明，幾乎所有高等植物的各種器官，如根、莖、葉和花等，以及各種組織，如皮層、莖髓和形成層等，離體后在適當(dāng)條件下，都能產(chǎn)生愈傷組織。

愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來源和種類，而是培養(yǎng)條件，其中激素的種類和濃度最為重要。當(dāng)然，外植體的類型和外植物體原來在植株上所處的位置（反映了內(nèi)源激素水平）對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響也不能忽視。

外植體中已分化的活細(xì)胞，在外源激素的誘導(dǎo)下通過脫分化后形成愈傷組織，這一過程被大致劃分為三個(gè)時(shí)期誘導(dǎo)期分裂期形成期4.1.2愈傷組織形成的過程誘導(dǎo)期：細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備期☆誘導(dǎo)期是細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時(shí)期。接種的外植體材料的細(xì)胞通常都是成熟細(xì)胞，處于靜止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞大小沒有多大變化，外觀無明顯特征，但細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝旺盛，王凱基等（1981）在研究離體培養(yǎng)的油橄欖莖段時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)合成代謝活躍，RNA含量迅速增加，細(xì)胞核體積明顯增大?！钫T導(dǎo)期的長(zhǎng)短，因植物種類和外植體的生理狀況和外部因素而異，如胡蘿卜的誘導(dǎo)期要好幾天，新鮮的菊芋塊莖則只要22h，但菊芋塊莖經(jīng)過5個(gè)月的貯藏后，誘導(dǎo)期則須延長(zhǎng)到40h以上。分裂期：細(xì)胞從開始分裂到持續(xù)分裂的時(shí)期分裂期是指細(xì)胞通過一分為二的分裂，不斷增生子細(xì)胞的過程。外植體的細(xì)胞一旦經(jīng)過誘導(dǎo)，其外層細(xì)胞開始迅速分裂，分裂期主要表現(xiàn)如下：1.細(xì)胞的數(shù)目迅速增加。如胡蘿卜培養(yǎng)7天后，細(xì)胞數(shù)可增加10倍。2.每個(gè)細(xì)胞平均鮮重下降。這是由于細(xì)胞鮮重的增加不如細(xì)胞數(shù)目的增加快的緣故。3.細(xì)胞體積小，內(nèi)無液泡，如同根尖和莖尖的分生組織細(xì)胞特性。4．細(xì)胞的核和核仁增大到最大。5.隨著細(xì)胞不斷分裂和組織生長(zhǎng)，細(xì)胞的總干重、蛋白質(zhì)和核酸含量大大增加，新細(xì)胞壁的合成極快。

總之，分裂期的愈傷組織的共同特征是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)。形成期：從愈傷組織到器官發(fā)生形成期是指外植體經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期后形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織的時(shí)期。進(jìn)入形成期后，細(xì)胞的平均大小相對(duì)穩(wěn)定，不再減少，細(xì)胞分裂由原來局限在組織外緣的平周分裂轉(zhuǎn)為組織內(nèi)部較深層局部細(xì)胞的分裂，結(jié)果形成瘤狀或片狀的擬分生組織（meristemoid），稱做分生組織結(jié)節(jié)。分生組織結(jié)節(jié)可以成為愈傷組織的生長(zhǎng)中心，或者進(jìn)一步分化為維管組織結(jié)節(jié)——由分生組織結(jié)節(jié)外圍的細(xì)胞作平周分裂成為形成層狀細(xì)胞，并形成了部分維管組織如管胞、纖維細(xì)胞等，但不形成維管系統(tǒng)。此期細(xì)胞分裂已基本停止，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等的變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能的細(xì)胞，因此有人又將此期稱為分化期。以上對(duì)愈傷組織形成過程的時(shí)期的劃分并不具有嚴(yán)格的意義，實(shí)際上，特別是分裂期和形成期往往可以出現(xiàn)在同一塊組織上。另外，有一些研究者曾反復(fù)指出的，雖然細(xì)胞脫分化的結(jié)果在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但這絕不意味著所有的細(xì)胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織。相反，脫分化后可直接分化為胚性細(xì)胞而形成體細(xì)胞胚。1

愈傷組織的生長(zhǎng)

一般來說，愈傷組織的增殖生長(zhǎng)只發(fā)生在不與瓊脂接觸的表面，而與瓊脂接觸的一面極少細(xì)胞增殖，只是細(xì)胞分化形成緊密的組織塊。4.1.3愈傷組織增殖的方式

外植體的脫分化因植物種類和器官及其生理狀況而有很大差別，如煙草、胡蘿卜等脫分化較易，而禾谷類的脫分化較難；花器脫分化較易，而莖葉較難；幼嫩組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。煙草愈傷組織在8周培養(yǎng)期間形態(tài)的變化A是與瓊脂培養(yǎng)基垂直方向的切面B是與瓊脂培養(yǎng)基平行方向的切面

一個(gè)多細(xì)胞外植體通常包含著各種不同類型的細(xì)胞，因此，由它所形成的愈傷組織也是異質(zhì)性的，其中不同的組分細(xì)胞具有不同的形成完整植株或器官的能力，即不同的再分化能力。2愈傷組織的繼代培養(yǎng)

脫分化細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂，從而形成了愈傷組織，愈傷組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間以后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個(gè)過程叫做繼代。

通過繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織無限期地保持在不分化的增殖狀態(tài)。然而，如果讓愈傷組織留在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)而不繼代，它們則不可避免地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)。4.1.4愈傷組織的狀態(tài)及其調(diào)控

來源于不同植物或同一植物不同部位的愈傷組織,在顏色、結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)習(xí)性上都可能存在差異，如顏色黃或白；外觀光滑或粗糙；結(jié)構(gòu)致密或松脆；遺傳生理功能有胚性或無胚性。1優(yōu)良愈傷組織的特性（優(yōu)良的愈傷組織通常應(yīng)具備以下4個(gè)特性中的2-3個(gè)特性）①旺盛的自我增殖能力，以便用這些愈傷組織建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。②高度的胚性或再分化能力，以便從這些愈傷組織得到再生植物。③容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系，并且在需要時(shí)能從中分離出全能性的原生質(zhì)體。④經(jīng)過長(zhǎng)期繼代保存而不喪失胚性，有便有可能對(duì)它們進(jìn)行各種遺傳操作。2.愈傷組織的類型

主要根據(jù)對(duì)小麥、高粱和玉米等禾谷類植物體細(xì)胞愈傷組織的研究，王海波將愈傷組織分為3種主要類型：類型Ⅰ：保守分裂型，結(jié)構(gòu)致密，生長(zhǎng)較慢，容易分化成苗類型Ⅱ：亢進(jìn)分裂型，結(jié)構(gòu)松脆，生長(zhǎng)旺盛，色澤鮮艷，增殖很快類型Ⅲ：衰敗型，結(jié)構(gòu)疏松，生長(zhǎng)緩慢，色澤暗淡注意：1.在這3種類型之間還存在許多過渡類型。

2.類型Ⅰ和類型Ⅱ之間在一定程度上可以相互轉(zhuǎn)變，衰變型細(xì)胞在一定程度上也可以得到控制。

能夠促進(jìn)這種轉(zhuǎn)變和控制的因子有幾種，其中最主要的是植物激素和氮源形態(tài)。

氮源除了供給培養(yǎng)物氮素營(yíng)養(yǎng)外，氨態(tài)氮還具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，硝態(tài)氮具有抑制細(xì)胞分裂的作用。當(dāng)增加生長(zhǎng)素濃度促進(jìn)細(xì)胞分裂的效果不明顯時(shí)，增加培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮可起到明顯的促進(jìn)分裂的作用；當(dāng)使用細(xì)胞分裂素或降低生長(zhǎng)素對(duì)細(xì)胞分裂的抑制效果不顯著時(shí)，增加培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮或減少氨態(tài)氮，可起到顯著的抑制分裂的作用。致密愈傷組織（A）與疏松愈傷組織（B）細(xì)胞結(jié)構(gòu)的比較1.巨大細(xì)胞；2.管狀細(xì)胞；3.細(xì)胞間隙3愈傷組織狀態(tài)的調(diào)控（1）選擇適當(dāng)?shù)幕蛐秃瓦m當(dāng)?shù)耐庵搀w

雖然幾乎所有高等植物的器官和組織都有可能產(chǎn)生愈傷組織，但同一物種內(nèi)不同基因型在離體培養(yǎng)中的反應(yīng)可能不同，同一植株不同部位的細(xì)胞在離體培養(yǎng)中的反應(yīng)也可能不同。基因型材料的基因型對(duì)愈傷組織的器官分化有決定性的影響。不同植物種的器官分化明顯不同，如煙草、胡蘿卜和矮牽年等植物容易誘導(dǎo)器官形成，而禾谷類、豆類、棉花等就比較困難。器官和部位

通常同一種植物的不同器官或組織所形成的愈傷組織，無論在生理上或形態(tài)上，其差別均不大。但是對(duì)有些植物而言，確有明顯差異。如油菜的花器官比葉、根易于分化成苗，水稻和小麥幼穗的苗分化頻率也比其他器官為高。年齡年齡較幼的外植體，不僅易于誘導(dǎo)形成愈傷組織，而且也容易誘導(dǎo)分化成植株。如油菜植株的自下而上的莖段的培養(yǎng)結(jié)果表明，下部的器官形成頻率低，愈向上部，苗的分化頻率越高。因此在組織培養(yǎng)中，要及時(shí)轉(zhuǎn)移已形成的愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)，可大大提高苗的分化頻率。2.選擇正確的培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的各種成分和物理性質(zhì)，都對(duì)器官發(fā)生產(chǎn)生一定影響，但起決定作用的仍然是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，特別是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的配比。3.采用某些特殊的理化因素改變愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。

加入一些常規(guī)培養(yǎng)基中不用的物質(zhì)和條件。4.2器官分化

愈傷組織分生細(xì)胞團(tuán)可進(jìn)行再分化，即進(jìn)行形態(tài)建成，可再產(chǎn)生完整的植株。形態(tài)建成：外植體在適宜的培養(yǎng)條件下經(jīng)脫分化、再分化或直接發(fā)育成各種形態(tài)完整的植物體的過程。

在愈傷組織培養(yǎng)物中，細(xì)胞分裂常以無規(guī)則方式發(fā)生，并產(chǎn)生無明顯形態(tài)或極性的無序結(jié)構(gòu)組織塊，這時(shí)雖然在愈傷組織中發(fā)生了細(xì)胞分化，形成維管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)，但并無器官發(fā)生。只有滿足某些條件，才可從愈傷組織發(fā)生再分化而產(chǎn)生苗或根的分生組織，甚至胚狀體，進(jìn)而使它發(fā)育成苗或完整植株。4.2.1器官發(fā)生概念：離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。發(fā)生方式：有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：外植體直接分化成器官的過程。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官發(fā)生）（2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。

在組織培養(yǎng)中，從外植體形成器官或無性系的形態(tài)發(fā)生，有下面兩種途徑：1．器官發(fā)生途徑通過莖芽的分化形成不定芽實(shí)現(xiàn)，指細(xì)胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細(xì)胞和組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。器官發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的基本方式有3種：（1）先形成芽，再在芽伸長(zhǎng)后，在其莖的基部長(zhǎng)出根而形成小植株，多數(shù)植物屬這種情況；（2）先產(chǎn)生根，再?gòu)母幕糠只鲅慷纬尚≈仓辍＿@種情況較難誘導(dǎo)芽的形成，尤其對(duì)于單子葉植物；（3）先在愈傷組織的鄰近不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來形成一株小植株。顛茄懸浮培養(yǎng)細(xì)胞先分化根后形成芽的過程2．胚狀體方式（somaticembryo）

指由培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化出的胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長(zhǎng)成完整植株。（后一節(jié)中介紹）4.2.2影響莖芽分化的因素1化學(xué)因素主要是激素的種類和濃度。

生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長(zhǎng)素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。

高有利于根的形成和愈傷組織的形成

生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素適中有利于根芽的分化低有利于芽的形成

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.05-5mg／L，細(xì)胞分裂素0.05—10mg／L。GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsTheexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfacetissuecultureintheAfricanVioletNosucrose(0%)Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.tissuecultureintheAfricanViolettissuecultureintheAfricanVioletSucrosereducedto1%Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredtissuecultureintheAfricanVioletSucroseincreasedto5%Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAP

Profusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletBAPreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplanttissuecultureintheAfricanVioletNoNAAPoorshootdevelopmentandnorootstissuecultureintheAfricanVioletNAAreducedto0.1mg.l-1

Poorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationtissuecultureintheAfricanVioletProfusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNAAincreasedto5.0mg.l-1tissuecultureintheAfricanVioletNosignofregenerationfromexplantatall.

NoMSsaltstissuecultureintheAfricanVioletSomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsreducedto0.47g.l-1

tissuecultureintheAfricanVioletShootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.MSsaltsincreasedto9.52g.l-1

2物理因素培養(yǎng)基形式：在固體培養(yǎng)基上，粉藍(lán)煙草×郎氏煙草的組織培養(yǎng)物以一種完全無結(jié)構(gòu)的狀態(tài)生長(zhǎng)，但在成分相同的液體培養(yǎng)基中，則能形成茂密的莖芽。滲透壓：在一個(gè)雙單倍體馬鈴薯品種葉肉原生質(zhì)體獲得的愈傷組織中，只有在培養(yǎng)基里加入0.2-0.3mol/L甘露醇以使?jié)B透壓保持在200-400毫滲透壓摩爾時(shí)，才可能出現(xiàn)莖芽的分化。否則，愈傷組織不能變綠，而愈傷組織變綠是芽分化的前提。光強(qiáng)和光質(zhì)：高強(qiáng)度的光照對(duì)煙草莖芽的形成有抑制作用，天竺葵愈傷組織只有在光照和黑暗交替條件下才能分化莖芽，培養(yǎng)在連續(xù)光照下無器官分化。溫度：Skoog在5-33℃的范圍內(nèi)研究了溫度對(duì)煙草愈傷組織分化和生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)直到33℃時(shí)愈傷組織的生長(zhǎng)都隨溫度的上升而增加，但只有在18℃時(shí)最適合莖芽的分化，在33℃時(shí)不能形成莖芽。3其它因素培養(yǎng)材料的染色體組供提植株和外植體的生理狀態(tài)外植體的細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)培養(yǎng)物的歷史和內(nèi)生激素水平。4.3體細(xì)胞胚胎發(fā)生4.3.1體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方式有兩種發(fā)生方式（1）直接發(fā)生：從培養(yǎng)的器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體直接分化成胚，中間不經(jīng)過愈傷組織階段。（2）間接發(fā)生：外植體先愈傷化，然后由愈傷組織再分化成胚。A.由外植體外層細(xì)胞直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚B.由外植體組織內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞胚C.愈傷組織表層細(xì)胞分化為體細(xì)胞胚4.3.2影響體細(xì)胞胚胎發(fā)生的因素

1．生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（1）生長(zhǎng)素類：

我們以離體培養(yǎng)條件下胡蘿卜的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)過程來進(jìn)行分析：

在離體條件下胡蘿卜體細(xì)胞胚的發(fā)育是一個(gè)包括兩個(gè)步驟的過程，每個(gè)步驟需要一種不同的培養(yǎng)基。

愈傷組織的建立和增殖所需要的是一種含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基（增殖培養(yǎng)基），通常所用的生長(zhǎng)素是2，4-D，濃度范圍0.5～1mg/L。在這樣一種培養(yǎng)上，愈傷組織的若干部位分化形成分生細(xì)胞團(tuán)，稱作“胚性細(xì)胞團(tuán)”（CE)。在增殖培養(yǎng)基上反復(fù)繼代，胚性細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量不斷增加，但并不出現(xiàn)成熟的胚。然而，如果把胚性細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到一種生長(zhǎng)素含量很低或完全沒有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)（成胚培養(yǎng)基）上，它們就能發(fā)育為成熟的胚?？磥恚谠鲋撑囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)素的存在，對(duì)于胚性細(xì)胞團(tuán)后來在成胚培養(yǎng)基上發(fā)育為胚是必不可少的。連續(xù)保存在無生長(zhǎng)素培養(yǎng)基中的愈傷組織不能形成胚。在這個(gè)意義上，可把增殖培養(yǎng)基看成是體細(xì)胞胚胎發(fā)生的“誘導(dǎo)培養(yǎng)基”，而把每個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)看成是一個(gè)無結(jié)構(gòu)的胚。野生胡蘿卜懸浮培養(yǎng)中體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的模式圖（2）細(xì)胞分裂素類：

細(xì)胞分裂素對(duì)于體細(xì)胞胚胎發(fā)生的作用有相反的結(jié)論，既可促進(jìn)也可抑制體細(xì)胞胚的發(fā)生，這主要取決于植物的種類及其基因型。

一般而言，細(xì)胞分裂素對(duì)于促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟有顯著作用，特別有利于子葉的發(fā)育。

另外有研究表明，不同的外植體對(duì)于細(xì)胞分裂素的需要可能具有不同的專一性，如在胡蘿卜的研究中發(fā)現(xiàn)，雖然BAP和激動(dòng)素對(duì)胚胎發(fā)生過程表現(xiàn)抑制作用，但濃度為0.1μmol/L的玉米素卻能促進(jìn)這個(gè)過程，而BA對(duì)胡蘿卜則是促進(jìn)其愈傷組織的增殖，但不形成胚性愈傷組織。（3）赤霉素類：赤霉素類能抑制體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但對(duì)于許多植物而言，赤霉素對(duì)于體細(xì)胞胚胎的成熟與萌發(fā)有促進(jìn)作用。（4）脫落酸：抑制劑特別是ABA，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的作用正逐漸被提示出來，ABA是一種天然產(chǎn)生的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，當(dāng)把無抑制作用劑量（通常是0.1~1μM）的ABA用于荷蘭芹屬培養(yǎng)物時(shí)，可以允許胚成熟過程進(jìn)行。但是其抑制異常增殖，包括不定胚的啟動(dòng)。另一方面抑制早熟萌發(fā)。2氮源

氮源的形態(tài)有還原態(tài)氮（NH4+）和氧化態(tài)氮（NO3－）兩種。

在以KNO3為唯一氮源（如White培養(yǎng)基）的培養(yǎng)上建立起來的愈傷組織，去掉生長(zhǎng)素以后不能形成胚。然而是，若在培養(yǎng)基中加入少量NH4Cl即可明顯促進(jìn)胚狀體的發(fā)育，上述結(jié)論是否說明，胚胎發(fā)生過程中還原態(tài)氮是必需的？我們可以對(duì)以下的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。Reinert及其合作者在栽培胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中(培養(yǎng)基均為White培養(yǎng)基)得到以下結(jié)果：

[NH4+—氮]（M）[NO3——氮]（M）體胚發(fā)生數(shù)（個(gè)/2ml）

10401131±2190550.9±0.309511.3±4.1

從上表可以分析得出，盡管高濃度的氧化態(tài)氮同樣可以誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，但是其誘導(dǎo)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于還原態(tài)氮和氧化態(tài)氮配合使用時(shí)的誘導(dǎo)率。

與KNO3不同，當(dāng)以NH4Cl為唯一氮源時(shí)，只要經(jīng)常調(diào)節(jié)pH值使其保持在5.4，胚胎發(fā)生率可與在NH4Cl和KNO3

最適配比的情況下相當(dāng)。當(dāng)只有NH4Cl時(shí)，培養(yǎng)基的pH值在4d之內(nèi)將有5.4降到4～3.5，這對(duì)胚胎發(fā)生是有抑制作用的。由此看來，還是搭配使用NH4＋和NO3－較為方便。3其它因子鉀離子的濃度:高濃度的鉀(20mmol／L)是胚胎發(fā)生所必須的。培養(yǎng)基中溶解氧的含量：應(yīng)低于一個(gè)臨界值（1.5mg／L），否則有利于生根，而不利于成胚。低溶解氧、高ATP活性炭:由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段：4.3.3體細(xì)胞胚胎的成熟過程1)外植體細(xì)胞脫分化。外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。這一階段同不定芽方式一樣。2)胚狀體形成細(xì)胞經(jīng)脫分化后，發(fā)生持續(xù)細(xì)胞分裂增殖，并依次經(jīng)過原胚期、球形胚期、心形胚期、魚雷形胚期和子葉期，進(jìn)而成為成熟的有機(jī)體。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。3)胚狀體再發(fā)育成完整植株在外觀上，這種方式和不定芽均有光滑、圓形突起的形狀。在活體和離體條件下胚和莖芽的下端在解剖學(xué)上的差別A、D、F是胚B、C、E是莖芽胚狀體與不定芽的區(qū)別胚狀體在組織學(xué)上具備以下和不定芽不同的三個(gè)特征：①最根本的特征是具有兩極性，即在發(fā)育的早期階段，從其方向相反的兩端分化出莖端和根端，而不定芽或不定根都為單向極性。②胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽或不定根往往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系。③胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“v”字形，而不定芽的維管組織無此現(xiàn)象。胚狀體也是植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生最常見而重要的方式，它較不定芽方式有更多的優(yōu)點(diǎn)：如胚狀體產(chǎn)生數(shù)量比不定芽多；胚狀體可制成人工種子，便于運(yùn)輸和保存；胚狀體的有性后代遺傳性更接近母體植株。這些對(duì)組織培養(yǎng)應(yīng)用于育種是十分有利而重要的。合子胚胚狀體質(zhì)量萌發(fā)率高，質(zhì)量好萌發(fā)率低，質(zhì)量差來源受精卵體細(xì)胞胚柄有，明顯即使有也不明顯形態(tài)固定，體積相對(duì)較小復(fù)雜，常有兩個(gè)以上的子葉體積相對(duì)較大變異率低高胚狀體與合子胚的比較體細(xì)胞胚常常能在原來的培養(yǎng)基上成熟和萌發(fā)。注意：在不經(jīng)冷處理種子就不能萌發(fā)的物種中，幼齡或成熟的胚可能必須先經(jīng)歷一段低溫之后才能正常的長(zhǎng)成小植株。葡萄體細(xì)胞胚：低溫處理時(shí)期球形期～成熟期均可低溫處理溫度4℃2周花菱草體細(xì)胞胚低溫處理后才能萌發(fā)。柑橘屬植物草體細(xì)胞胚萌發(fā)期間，需要使用GA3以促進(jìn)根和莖的發(fā)育。4.3.4長(zhǎng)期培養(yǎng)物形態(tài)發(fā)生潛力的喪失

有些愈傷組織或懸浮培養(yǎng)物起初具有器官發(fā)生或胚胎發(fā)生的潛力，但經(jīng)過反復(fù)繼代保存之后，這種形態(tài)發(fā)生能力常常逐漸下降，有些甚至完全損失。為了解釋這種現(xiàn)象，現(xiàn)在有三種假說。1遺傳說該假說認(rèn)為，形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是由于在培養(yǎng)細(xì)胞中的核的特性發(fā)生了改變，即細(xì)胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)在培養(yǎng)繼代過程中由于變異等原因而發(fā)生了改變或是突變。因此，由這種原因所造成的形態(tài)發(fā)生潛力的喪失是不可逆的。2生理說隨著不斷的培養(yǎng)繼代的進(jìn)行，培養(yǎng)組織或細(xì)胞中的內(nèi)源激素平衡關(guān)系可能會(huì)發(fā)生改變或是由于對(duì)外源生長(zhǎng)物質(zhì)的敏感性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致不能形態(tài)發(fā)生。在這種情況下，細(xì)胞雖然停止了器官和胚胎的分化，但并不一定就喪失了這種分化能力。因而，在這種情況下，如果改變外部處理?xiàng)l件，應(yīng)該有可能使細(xì)胞的這種內(nèi)在潛力得到恢復(fù)。

如Fridborg和Eriksson(1975)發(fā)現(xiàn)，在含有2，4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)8周之后，本來具有全能性的胡羅卜培養(yǎng)物完全停止了胚胎發(fā)生的過程，然而，向這種培養(yǎng)基中加入1％～4％的活性炭之后，喪失了的全能性又可以得以恢復(fù)。在這個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)中，胚性潛力的喪失可能是由于內(nèi)源生長(zhǎng)素水平提高所致。3競(jìng)爭(zhēng)說這個(gè)假說本質(zhì)上是前兩個(gè)假說的結(jié)合。按照這個(gè)假說的倡議者Smith和Street（1974）的看法，在胡蘿卜細(xì)胞長(zhǎng)期連續(xù)繼代培養(yǎng)基間，有兩個(gè)過程可能與胚胎發(fā)生能力的下降以至最終的喪失有關(guān)。首先，細(xì)胞對(duì)于生長(zhǎng)素（2，4-D）抑制全能性表達(dá)的作用變得比較敏感；其次，隨著時(shí)間的推移，由于培養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞學(xué)上的不穩(wěn)定性，出現(xiàn)了缺乏胚性潛力的新的細(xì)胞系，這些細(xì)胞學(xué)上的變化不一定是染色體數(shù)目的變化，而可能只是遺傳信息的小的突變、丟失或易位，實(shí)際上，Jones（1974）已經(jīng)證實(shí)，在胡蘿卜培養(yǎng)物中，細(xì)胞群體在成胚能力上的不穩(wěn)定性，可能是由用于建立該培養(yǎng)物的組織帶來的。

在復(fù)雜的多細(xì)胞外植體中，只有少數(shù)細(xì)胞能夠產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，其余細(xì)胞都是無法表達(dá)其全能性的。即存在胚性的細(xì)胞類型和非胚性的細(xì)胞類型按照這種假說，如果非胚性的細(xì)胞類型在所用的培養(yǎng)基中具有生長(zhǎng)上的選擇優(yōu)勢(shì)，在反復(fù)的繼代培養(yǎng)中，非胚性細(xì)胞的群體將會(huì)愛步增加，而胚性成分則逐漸減少。到了一定時(shí)期之后，在培養(yǎng)物中已不再含有任何胚性細(xì)胞，這時(shí)若想再恢復(fù)它們的胚胎發(fā)生能力就不可能了。然而，如果在培養(yǎng)物中存在少量胚性細(xì)胞，只是由于處在支配地位的非胚性細(xì)胞的抑制作用，這些胚性細(xì)胞的全能性無法表達(dá)，在這種情況下，通過改變培養(yǎng)基成分，使之有選擇地促進(jìn)全能細(xì)胞的增殖，就應(yīng)當(dāng)有可能恢復(fù)該培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā)生潛力。4.5人工種子

人工種子（artificial

seed）是指通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，外面還被有特定物質(zhì)，在適宜條件下可以發(fā)芽成苗的植物幼體。

最早提出人工種子概念的是著名植物組織培養(yǎng)學(xué)家Murashige。他于1978年在加拿大召開的第四屆國(guó)際植物組織細(xì)胞培養(yǎng)會(huì)議上，首次提出利用植物組織培養(yǎng)中具有體細(xì)胞胚胎發(fā)生的特點(diǎn)，把胚狀體等組織包埋在膠囊內(nèi)形成球狀結(jié)構(gòu)，使其具有種子的機(jī)能并可直接播種于田間的設(shè)想。

按照他的設(shè)想，“人工種子’，最外面為一層有機(jī)的薄膜包裹，起防止水分散失及保護(hù)作用。其中含有培養(yǎng)物所需的營(yíng)養(yǎng)成分和某些植物激素，以作為植物材料萌發(fā)時(shí)的刺激因素并提供能量，最里面就是被包埋的胚狀體或芽體等植物材料。通過這幾部分的組合，人為地創(chuàng)造出一種與天然種子相類似的人工合成種子（syntheticseed)，因此又叫人造種子（manmadeseed.）或無性種子（somaticseed)。

人工種子制作程序：1.高質(zhì)量體細(xì)胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)的建立2.體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化控制3.人造種皮及人造胚乳研制與包埋4.人工種子的轉(zhuǎn)換（體細(xì)胞胚胎發(fā)育成據(jù)正常表現(xiàn)型的綠色植株的能力）5.1快速繁殖的操作程序階段Ⅰ:無菌培養(yǎng)物的建立;階段Ⅱ:莖芽的增殖;階段Ⅲ:離體形成的枝條的生根;階段Ⅳ:植株的移栽.5園藝植物快速繁殖技術(shù)和無病毒良種的繁育5.1.1無菌培養(yǎng)物的建立⑴外植體:最適用的是帶芽的莖段；莖尖;花序（花椰菜）其它組織、器官由植物種類和莖芽增殖方法而定①有些植物的特殊園藝性狀是由病毒造成的。如天竺葵品種“鱷魚”的透明葉脈，脫毒后消失。如天竺葵品種”鱷魚”的莖尖培養(yǎng)（上）和葉柄培養(yǎng)（下）注意：②通過形成不定芽進(jìn)行快繁時(shí)，可用根段、莖段或珠心做外植體，由天然形成不定芽的能力決定③一般不通過愈傷組織進(jìn)行快繁。⑵消毒：無菌外植體；溫室栽培；套袋；水培5.1.2

莖芽增殖的4種途徑

莖芽的離體增殖，除了蘭花所特有的原球莖途徑之外，有以下4個(gè)途徑：通過愈傷組織通過不定芽形成單芽莖段扦插增強(qiáng)腋芽生枝注意愈傷組織培養(yǎng)的缺點(diǎn)：（1）通過愈傷組織是進(jìn)行植物繁殖最快的方法。①細(xì)胞在遺傳上的不穩(wěn)定性；②隨著繼代保存時(shí)間的增加，愈傷組織最初表現(xiàn)的植株再生能力可能逐漸下降，最后甚至完全消失。原理：無限增殖的可能性；細(xì)胞的全能型

Ⅰ愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo)

小紅楓的組織培養(yǎng)

Ⅱ

愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的再生Ⅲ

生根Ⅳ

煉苗移栽（2）不定芽形成：根、鱗莖和葉都能形成不定芽。有350個(gè)物種，他們的葉都能形成不定芽。

在培養(yǎng)條件下，植物產(chǎn)生不定芽的頻率可以顯著提高。

如在秋海棠中，一般情況下芽只是沿著切口形成，但在含有BAP的培養(yǎng)基中，可在整個(gè)外植體的表面形成。

據(jù)Takayama等報(bào)道有一種秋海棠幼葉的7mm×7mm的切段在1年中產(chǎn)生了1014個(gè)植株。花斑天竺葵品種MmeSalleron莖尖培養(yǎng)（上）和葉柄節(jié)段培養(yǎng)（下）不定芽培養(yǎng)會(huì)招致嵌合體裂解。（3）增強(qiáng)腋芽生枝能力原理：雛梢（4）單芽莖段扦插11.2.3影響莖芽增殖的因素⑴培養(yǎng)基無機(jī)鹽激素⑵光照和溫度：光強(qiáng)：光的作用只是滿足某些形態(tài)發(fā)育過程的需要，因此1000~5000lx的光強(qiáng)即已足夠。光周期嚴(yán)格的說也不重要。每天16h光照/8h黑暗交替照明，即可產(chǎn)生令人滿意的效果。光照:溫度：25℃（1）試管內(nèi)生根：當(dāng)小枝條長(zhǎng)1cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)插到生根培養(yǎng)基中。

若莖芽增殖是在全強(qiáng)度MS培養(yǎng)基上進(jìn)行的，生根培養(yǎng)基中鹽的濃度應(yīng)減少到1/2或1/4。5.1.4離體形成的枝條的生根

對(duì)于大多數(shù)物種來說，誘導(dǎo)生根需要有適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)素，其中最常用的是NAA和IBA，濃度一般為0.1~10.0mg/L，但唐菖蒲、水仙和草莓等例外，它們的枝條很容易在無激素培養(yǎng)基上生根

也可將枝條下端浸在高濃度生長(zhǎng)素溶液中若干時(shí)間（由幾秒到幾個(gè)小時(shí)）后，再插于無激素培養(yǎng)基中生根所需時(shí)間由10d到15d不等。根長(zhǎng)5mm時(shí)移栽最為方便。（2）試管外生根：

先用激素處理，再插于基質(zhì)中，或先誘導(dǎo)出根原基，再扦插。

試管內(nèi)嫁接:有叫微體嫁接，即以試管苗的0.1~0.2mm長(zhǎng)的莖尖為接穗，以在試管內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)出來的帶根無菌苗為砧木，在無菌條件下借助顯微鏡進(jìn)行嫁接，之后繼續(xù)在試管內(nèi)培養(yǎng)，愈合后成為完整植株再移入土中。5.1.5無根苗的嫁接試管外嫁接：砧木可大可小。微嫁接技術(shù)在一些園藝植物上都有成功的報(bào)道,如柑桔、櫻桃、阿月渾果子樹、核果、蘋果、葡萄等果樹。5.1.6壯苗、煉苗和移栽

試管苗生長(zhǎng)在恒溫、高濕、弱光、無菌和有完全營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的特殊條件下，雖有葉綠素，但營(yíng)異養(yǎng)生活，因此在形態(tài)解剖和生理特性上都有很大脆弱性，例如水分輸導(dǎo)系統(tǒng)存在障礙，葉面無角質(zhì)層和蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備關(guān)閉功能等。

壯苗：

是移栽成活的首要條件，但培育壯苗的方法則因材料和情況的不同而異。如在培養(yǎng)基中加入一定數(shù)量的生長(zhǎng)延緩劑如pp333、B9、CCC等，在許多植物上都可獲得壯苗。

煉苗：

開瓶煉苗降低瓶中濕度，增強(qiáng)光合強(qiáng)度，以便促使葉表面逐漸形成角質(zhì)，促使氣孔逐漸建立開閉機(jī)制，促使葉片逐漸啟動(dòng)光合功能等。煉苗的具體措施：

則因苗的種類不同而異。

有些單子葉草本植物，只要壯苗，煉苗方法十分簡(jiǎn)單：拿掉封口塑料膜，在培養(yǎng)基表面加上薄薄一層自來水，置于散射光下3~5d即可。

有些植物如霞草和刺槐試管苗極易萎蔫，封口膜在煉苗開始時(shí)只能半開，且要求煉苗環(huán)境有較高的空氣濕度。

喜光植物如棗和刺槐可在全光下煉苗，耐蔭植物如玉簪和白鶴芋等則須在較蔭蔽的地方煉苗，萱草、月季、福祿考、油茶等可在50%~70%的遮蔭網(wǎng)下煉苗。移栽：

移栽時(shí)先要輕輕地但徹底地洗掉沾在根上的瓊脂培養(yǎng)基，以免栽后發(fā)霉。

要選用排水性和透氣性良好的移栽介質(zhì)，如蛭石、河沙、珍珠巖、草炭和腐質(zhì)土等，栽苗之前須用0.3%~0.5%的高錳酸鉀消毒。

移栽后，最初10~15d要通過噴霧或罩上透明塑料以保持很高的濕度（90%~100%），在塑料罩上可打些小孔，以利氣體交換。在保濕數(shù)天之后，可把植株搬入溫室，但仍須遮蔭數(shù)日。移栽時(shí)把小植株上的一部分葉片剪掉也可能是有益的。移栽苗成活的必要條件是：

空氣濕度高，土壤通氣好，太陽(yáng)勿直照。

移栽后完成上述各個(gè)步驟可能需花費(fèi)4~6周的時(shí)間，此后即可讓這些植物在正常溫室或田間條件下生長(zhǎng)。

熱處理是應(yīng)用最早的脫毒技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、見效快的特點(diǎn)。5.2培養(yǎng)脫毒苗的原理和方法5.2.1

通過熱處理消除病毒柑橘脫毒容器育苗

熱處理的理論依據(jù)是在高溫下病毒鈍化，復(fù)制明顯減弱或不再繁殖，而植物在高溫下生長(zhǎng)較快，將植物在高溫下培養(yǎng)數(shù)周至數(shù)月，這個(gè)期間生長(zhǎng)的嫩梢不帶病毒。

熱處理的關(guān)鍵問題是存活率和脫毒率，溫度和持續(xù)時(shí)間、熱處理方式等對(duì)存活率和脫毒率有影響。熱處理的方法：熱水處理：對(duì)休眠芽效果較好。熱空氣處理：對(duì)活躍生長(zhǎng)的莖尖效果較好。

把旺盛生長(zhǎng)的植株移入到一個(gè)熱療室中，在35~40℃下處理一定時(shí)間即可；處理時(shí)間的長(zhǎng)短可由幾分鐘到數(shù)周不等。Baker和Kinnaman（1973）把麝香石竹植株在38℃下連續(xù)處理2個(gè)月，從而消除了莖尖內(nèi)的所有病毒。

馬鈴薯病毒X則要求在35℃下處理幾個(gè)月才能得到一些無病毒莖尖。

熱處理時(shí)，最初幾天空氣溫度應(yīng)逐步增高，直到達(dá)到要求的溫度為止。若鈍化病毒所要求的連續(xù)高溫處理會(huì)傷害寄主組織，則應(yīng)當(dāng)試驗(yàn)高低溫交替的效果。熱處理后要立即把莖尖切下來嫁接到無病的砧木上。在熱處理期間應(yīng)當(dāng)保持適當(dāng)?shù)臐穸群凸庹铡?/p>

根據(jù)Baker和Kinnaman（1973）的建議，在對(duì)麝香石竹進(jìn)行脫毒熱處理時(shí)，相對(duì)濕度必須保持在85%~95%之間，準(zhǔn)備接受熱處理的植株必須具有豐富的碳水化合物儲(chǔ)備。并非所有的病毒都對(duì)熱處理敏感，如在馬鈴薯中，此法只能消除卷葉病毒。一般來說對(duì)于等徑的和線狀的病毒和已知的類菌原體引起的病害，熱處理有效。在用熱療法消除病毒時(shí)應(yīng)注意：延長(zhǎng)寄主植株的熱處理時(shí)間，也可能會(huì)鈍化植物組織中的抗性因子，因而和對(duì)照相比會(huì)降低處理效果。熱處理之后只有一小部分植株能夠存活。

李屬植物病毒一般在38℃左右可被鈍化，通常采用38℃作為處理溫度。但李屬植物耐熱性差，38℃恒溫處理死亡率高。

采取一些改進(jìn)措施可有效提高存活率，同時(shí)不影響脫毒率。這些措施包括晝夜變溫(38℃，16h，光照；25～30℃，8h，黑暗)；預(yù)先處理；降低土溫(29℃)，處理期間澆水；高CO2，降低根部溫度。

一般認(rèn)為高溫(38℃)長(zhǎng)時(shí)間處理，脫毒率高，但有的病毒是讓寄主植物在低溫下生長(zhǎng)一段時(shí)間來消除的，對(duì)于這些病毒侵染的植物變溫處理存活率和脫毒率均高于恒溫處理。

低溫處理結(jié)合微嫁接或莖尖培養(yǎng)，高濃度細(xì)胞分裂素、多次繼代結(jié)合低溫處理也是有效的脫毒途徑。5.2.2通過莖尖培養(yǎng)消除病毒W(wǎng)hite(1934)和Limasset等(1949)研究表明，病毒濃度呈梯度變化，病毒粒子隨植物組織的成熟而增加，旺盛生長(zhǎng)的根尖、莖尖很少有病毒分布。Morel等(1952)首次通過莖尖培養(yǎng)成功獲得脫毒的大麗花，以后莖尖培養(yǎng)相繼用于桃、櫻桃、櫻花、豆櫻、山櫻花等植物脫毒。

莖尖的成活率和脫毒率是莖尖脫毒培養(yǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。褐化是降低莖尖培養(yǎng)成活率的首要原因。

莖尖大小、取材季節(jié)、培養(yǎng)方式、激素濃度、基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物都對(duì)莖尖褐化有影響。莖尖越小，褐化越嚴(yán)重。

同等大小莖尖休眠季節(jié)取材、液體培養(yǎng)、添加低濃度激素成活率高于休眠前期或生長(zhǎng)期取材、固體培養(yǎng)、添加高濃度激素。莖尖和頂端分生組織的區(qū)別頂端分生組織（apicalmeristem，apicaldome）是指莖的最幼齡葉原基上方的一部分，最大直徑約100μm，最大長(zhǎng)度約為250μm。莖尖（shoottip，meristemtip，shootapex）是由頂端分生組織及其下方的1~3個(gè)幼葉原基一起構(gòu)成的。

雖然通過頂端分生組織培養(yǎng)獲得消除病毒的機(jī)會(huì)較高，但大多數(shù)無病毒植株都是通過培養(yǎng)100~1000μm長(zhǎng)的外植體得到的，即通過莖尖培養(yǎng)得到的。獲得表面不帶病原菌外植體的方法培養(yǎng)無病植株：無菌土、內(nèi)吸殺菌劑、水培；表面消毒：葉片包被嚴(yán)緊的芽如菊花、菠蘿、姜、蘭花等只需在75%的酒精中浸蘸一下；葉片包被松散的芽如蒜、麝香石竹、馬鈴薯等則要用0.1%次氯酸鈉溶液表面消毒10min。對(duì)于這些消毒方法，在工作中應(yīng)靈活運(yùn)用，以便適應(yīng)具體的實(shí)驗(yàn)體系。防莖尖失水解剖鏡細(xì)鑷子解剖針長(zhǎng)柄刀片閃亮半圓球的頂端分生組織或莖尖5.2.3熱處理+莖尖培養(yǎng)

頂端分生組織有時(shí)也帶有病毒，如麝香石竹莖尖100長(zhǎng)的頂端部分，有33%帶有麝香石竹班駁病毒，菊花中，有300~600長(zhǎng)莖尖的愈傷組織形成的全部植株都帶有病毒。

若把莖尖培養(yǎng)與熱療法結(jié)合起來，也有可能獲得脫毒植株。熱處理可在切取莖尖之前在母株上進(jìn)行，也可在莖尖培養(yǎng)期間進(jìn)行。用前一種方法可以切取較大的外植體進(jìn)行培養(yǎng)。

若連續(xù)高溫處理會(huì)引起受處理植株的組織損傷，可以試用晝夜或隔日高低溫交替處理。如為消除馬鈴薯芽眼中的馬鈴薯卷葉病毒，使用40℃（4h）＋6~20℃（20h）兩種溫度的交替處理。40℃連續(xù)高溫處理會(huì)殺死芽眼。5.2.4化學(xué)處理

目前國(guó)際上常用的是兩種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì):2,4-二氧六氫三氮雜苯(DHT)和類似嘌呤堿基代謝物質(zhì)病毒唑。

作用機(jī)理為這兩種物質(zhì)可抑制病毒復(fù)制。Deogrativos等報(bào)道培養(yǎng)基中添加病毒唑，甜櫻桃可脫除ACLSV、PNRSV、PDV。對(duì)蘋果田間植株直接噴施該類物質(zhì)也可獲得脫毒苗。⑴物種的局限性⑵無性系變異：變異的累積；愈傷組織；克服辦法：限制一個(gè)外植體的繁殖株數(shù)；限制離體繁殖周期的數(shù)目。5.3園藝植物組織培養(yǎng)中存在的問題和對(duì)策5.3.1

微繁中存在的一些問題⑶培養(yǎng)物污染：⑷玻璃化：

某些慢速生長(zhǎng)的病原菌（特別是內(nèi)生菌）可能依然存在。污染物的長(zhǎng)期存在會(huì)引起試管苗生活力下降，葉片缺綠，甚至死亡?？股鼗驓⒕鷦┯锌赡芸刂七@些污染物進(jìn)一步擴(kuò)展，但不可能殺滅這些污染物。最好的辦法是無毒外植體。

與正常組培苗相比，玻璃化苗在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了顯著變化，其共同特點(diǎn)是呈半透明狀，并且可分為外觀形態(tài)明顯異常和基本無異常2種類型。此外，玻璃苗的莖尖頂端分生組織相對(duì)較?。磺o尖發(fā)育部分保持分生能力的時(shí)期也縮短；葉片表面縮小或增大，葉片皺縮并縱向卷曲，脆弱易破碎，顏色不正常；幼苗難以生根等。

5.3.2玻璃化現(xiàn)象

褐化是指在離體繁殖過程中，由培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，培養(yǎng)材料也隨之變褐死亡的現(xiàn)象。加以控制。5.3.3培養(yǎng)基的褐變5.3.4變異

離體快繁可獲得大量形態(tài)、生理特性不變的植株，也可能出現(xiàn)些變異，特別是通過愈傷組織形成的或懸浮培養(yǎng)繁殖的幼苗，更具有普遍性。5.3.5污染

在離體繁殖過程中，細(xì)菌和真菌侵染培養(yǎng)基產(chǎn)生菌斑使培養(yǎng)材料不能正常生長(zhǎng)和發(fā)育，以至死亡的現(xiàn)象稱為污染。細(xì)菌污染的特點(diǎn)是菌斑呈黏液狀，在接種1～3d后即可發(fā)現(xiàn)。真菌污染的特點(diǎn)是污染部分會(huì)有不同顏色的霉菌，接種后3～10d才發(fā)現(xiàn)。牡丹的器官培養(yǎng)與快速繁殖外植體部位目前已報(bào)道的牡丹器官培養(yǎng)中，多數(shù)以鱗芽為外植體進(jìn)行研究，包括腋芽、土芽、花芽、頂芽,也有以其他部位如葉柄、葉片、上胚軸和萌生條等。在所有鱗芽中，以土芽的分化表現(xiàn)最好，分化率可達(dá)94%，花芽最差僅16%。

不同取材時(shí)期對(duì)芽培養(yǎng)也有影響：12月至次年2月取材，經(jīng)過低溫休眠，芽充分分化，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)累積豐富，苞片緊密，污染率低，成活率高，萌發(fā)時(shí)間早，因此，此時(shí)期取材最好。嫩葉愈傷組織的誘導(dǎo)率、不定芽的分化率均高于葉柄。萌生條的表現(xiàn)最差，不僅污染和褐變死亡現(xiàn)象嚴(yán)重，而且成活率很低，僅11.7%，難以分化。表面滅