飼料中辣椒紅的測定 高效液相色譜法 編制說明

飼料中辣椒紅的測定高效液相色譜法編制說明一、工作簡況根據(jù)《國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會關(guān)于下達(dá)2021年第四批推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)計劃及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)外文版計劃的通知》（國標(biāo)委發(fā)[2021]41號），“飼料中辣椒紅的測定高效液相色譜法”標(biāo)準(zhǔn)制定項目計劃編號20214681-T-469，起草單位為四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司、山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心。本標(biāo)準(zhǔn)由全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAC/TC76）提出并歸口。辣椒紅色素，又名辣椒紅，是從辣椒中提取的天然著色劑，主要著色成分為辣椒紅素和辣椒玉紅素，屬類胡蘿卜素，占總量的其在飼料中的應(yīng)用可以促進(jìn)動物健康、提高免疫力、增加產(chǎn)蛋量和肉蛋品質(zhì)。添加天然辣椒紅色素不僅可以感官上刺激動物的食欲和提高飼料的消化利用率。天然辣椒紅色素不僅可以促進(jìn)動物免疫功能的提高，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，它還具有一定的抗炎作用，緩解動物身體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)激反應(yīng)。添加天然辣椒紅色素不僅可以提高動物的產(chǎn)蛋量和肉質(zhì)品質(zhì)，還可以提高動物肉品的抗氧化能力和按照農(nóng)業(yè)部2045號公告《飼料添加劑目錄》規(guī)定，辣椒紅為著色劑類的飼料添加劑，適用范圍為家禽。按照農(nóng)業(yè)部2625號公告規(guī)定，辣椒紅在家禽飼料中的最高限量為80mg/kg。為指導(dǎo)飼料生產(chǎn)企業(yè)和用戶規(guī)范使用飼料添加劑辣椒紅，避免辣椒紅在家禽飼料中超量適用，或者在非家禽飼料中超范圍使用，有必要制定“飼料中辣椒紅的測定”農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，可有效規(guī)范指導(dǎo)飼料生產(chǎn)、保證飼料產(chǎn)品的質(zhì)量安全、保護(hù)人民群眾身體健康，同時為飼料管理部門查閱國內(nèi)外相關(guān)資料，目前測定辣椒紅的方法主要有薄層色譜法、比色法和液相色譜法。薄層色譜法僅能定性和半定量；比色法可以定量，但由于其它色素如葉黃素等在同一波長處也有吸收，使得測定結(jié)果不能準(zhǔn)確反映辣椒紅的含量；液相色譜法可以使得辣椒2022年3月，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心組織各起草單位召開線上標(biāo)準(zhǔn)制定啟動會，會上詳細(xì)研討了標(biāo)準(zhǔn)制定路線，明確各起草單位工作分工，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心負(fù)責(zé)技術(shù)路線的制定和實施，承擔(dān)辣椒紅素和辣椒玉紅素檢測方法的開發(fā)、樣品檢測和數(shù)據(jù)匯總分析，以及標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明等材料的編寫等工作；四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司負(fù)責(zé)負(fù)責(zé)整個標(biāo)準(zhǔn)的工作調(diào)度等；山東省飼料獸藥質(zhì)量檢驗中心、廣州智特奇生物科技股份有限公司、晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司負(fù)責(zé)樣品收集和文獻(xiàn)資料的查閱等工1.3.2標(biāo)準(zhǔn)修訂技術(shù)路線和方案制定2022年7月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組查閱了國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)資料，同時調(diào)研國內(nèi)主要辣椒紅生產(chǎn)企業(yè)、使用企業(yè)等標(biāo)準(zhǔn)方法采用情況，制定了標(biāo)準(zhǔn)制定內(nèi)容和技術(shù)路線方案，確定了標(biāo)準(zhǔn)制定的主要內(nèi)容、技術(shù)路線(見圖1)、分工、完成時限等。方法適用范圍方法適用范圍色譜方法開發(fā)方法學(xué)考察、實驗數(shù)據(jù)處理樣品收集、方法適用性考察方法驗證圖1標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)路線圖2022年8月~2023年8月，開展樣品收集、方法學(xué)研究和實際樣1.3.4編寫編制說明和征求意見稿2023年9月~11月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組完成標(biāo)準(zhǔn)文本、編制說明定向二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則和主要技術(shù)內(nèi)容確定的依據(jù)2.1標(biāo)準(zhǔn)編制原則準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》以及GB/T20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編制規(guī)則第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定和要求進(jìn)行(1)遵循國家頒布的相關(guān)法律法規(guī)；(2)有關(guān)國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)；(3)國內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和參考文獻(xiàn)；（4）標(biāo)準(zhǔn)編制小組調(diào)研和實測的樣品檢測數(shù)據(jù)。經(jīng)查閱相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，辣椒紅中辣椒紅素和辣椒玉紅素易溶于有機(jī)溶劑，在400nm-600nm范圍內(nèi)有紫外吸收，檢測儀器主要為分光光度儀和高效液相色譜儀等儀器設(shè)備。因為分光光度法是基于光吸收信號的檢測方法，本身并不具有分離功能，在某一波長下測得的吸光度值是所有物質(zhì)的吸光度之和，因此，并不能準(zhǔn)確定量某中規(guī)定，辣椒紅的有效成分為辣椒紅素和辣椒玉紅素，在配合飼料中最高限量為80mg/kg（以辣椒紅素計見表1）。所以，要定性表1農(nóng)業(yè)部2625號公告中辣椒紅素和辣椒玉紅素使用規(guī)定有效成分為（Capsanthin，CHO)和辣椒玉紅素,CHO）類胡蘿卜素總量≥中辣椒紅素和辣椒玉紅素總量占類胡蘿卜素總同時使在配合飼料中的總量不得超素和辣椒玉紅素色譜峰的光譜圖，如圖2。結(jié)果表明，辣椒紅素和辣椒玉紅素均在波長475nm附近有最大吸收峰，因此 A B圖2辣椒紅素和辣椒玉紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液光譜圖注：A.辣椒紅素；B.辣椒玉紅素分別考察了三種流動相對辣椒紅素和辣椒玉紅素出峰時間和峰形的影響。當(dāng)流動相結(jié)果見表2。結(jié)果表明，乙腈作為流動相使用時，目標(biāo)峰出峰時間太快，在2min以內(nèi)，溶劑峰等雜峰對其影響色譜柱上有較強(qiáng)的保留。乙腈+水梯度洗脫，將出峰時間控制在3表2流動相考察條件色譜條件流動相組成流動相比例（%）流速（mL/min）流動相1流動相275+25流動相3梯度洗脫表3梯度洗脫程序時間（min）乙腈（%）水（%）0.00752506.0006.1075257525色譜柱溫度對溶劑的溶解能力、色譜柱的性能、流動相的粘度都有一定的影響。分別考察色譜柱溫度為25℃、30℃、35℃和40℃時辣椒紅素、辣椒玉紅素液相色譜峰形和分離情況，結(jié)果見圖49。考察結(jié)果表明，隨著色譜柱溫度的升高，辣椒紅素、辣椒玉紅素的保留時間變化不明顯，系統(tǒng)壓力降低。在以上條件中，標(biāo)化合由于辣椒紅素和辣椒玉紅素的LogP分別為9.90和7.97，所以它們在反相色譜柱上能夠保留并被洗脫。本方法比較了實驗室反相色譜中常用的兩根短色譜柱，分別是柱長100mm、內(nèi)徑4.6mm、2.7μm的C8色譜柱，進(jìn)行色譜柱考察。在乙腈/水的梯度洗脫程序下，檢測波長為475nm，柱溫為35℃時，兩根色譜柱對辣椒紅素和辣椒玉紅素的保留情況相當(dāng)，都能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離和良好峰型。在上述色譜條件下，考察不同濃度辣椒紅素、辣椒玉紅素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的保留時間的精密度和穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，不同濃度辣椒紅素、辣椒玉紅素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液保留時間的RSD值均小于0.4%。在所選擇的色譜條件下，實際樣品中的色譜圖，辣椒紅素、辣椒玉紅素的分離度、穩(wěn)定性和專屬性滿足定性和定量測定要表4辣椒紅素和辣椒玉紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液精密度試驗待測保留時間(min)平均平行1素素保留時間(min)平均平行1素素辣椒紅素，分子式為C?oHs?O?,分子量為584.85,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖3所示。辣椒玉紅素，分子式為C?oHs?O?,分子量為600.85,圖3辣椒紅素結(jié)構(gòu)式辣椒紅色素是以辣椒為原料，采用科學(xué)方法提取、分離、精制而成的天然色素。主要成份為辣椒紅素和辣椒玉紅素，為深紅色油溶性液體，色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，耐光、熱、酸、堿，且不受金屬離子影響；溶于油脂和乙醇，亦可經(jīng)特殊加工制成水溶性或水分散從圖3、圖4可以看出，辣椒紅素和辣椒玉紅素均屬于弱極性化合物。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，我們選取基質(zhì)較為復(fù)雜的蛋雞配合飼料2g,空白基質(zhì)加標(biāo)量約為500μg/kg,分別使用乙腈、80%乙腈水溶液、5%甲酸乙腈、甲醇、5%甲酸甲醇、80%甲醇水溶液作為溶劑進(jìn)行提取，上機(jī)測定，計算其回收率，結(jié)果見下表5。表5蛋雞配合飼料不同提取溶劑回收率試驗結(jié)果(n=3)平均回收率(%)乙腈水5%甲乙腈甲醇5%甲酸甲醇水12由表4中回收率結(jié)果可知，乙腈和甲醇提取的回收率相當(dāng)，乙腈水的提取回收率最低，這可能和辣椒紅色素在有機(jī)溶劑中的溶解程度有關(guān)?？紤]到操作簡單以及環(huán)境影響程度，本實驗考慮采用乙蛋鴨配合飼料、蛋鴨預(yù)混料、蛋雞濃縮料和蛋鴨濃縮料各2g，添加成濃度約為500μg/kg，考察乙腈對其提取效率，結(jié)果見表6。結(jié)果表明，在所選基質(zhì)中，乙腈均具有良好的提取效率，因此最終選擇表6乙腈提取回收率試驗結(jié)果（n=3）序號待測組分平均回收率（%）蛋雞配合飼料蛋雞預(yù)混料蛋鴨配合飼料蛋鴨預(yù)混料蛋雞濃縮料蛋鴨濃縮料1辣椒玉紅素84.683.482.286.579.888.72辣椒紅素80.781.679.681.783.681.9為了驗證提取體積對測定結(jié)果的影響，實驗考察了采用10mL第2次乙腈提取到的目標(biāo)物含量在第一次提取的5試劑和時間且不影響實驗結(jié)果的原則，10mL乙腈提取1次即可滿表7不同提取次數(shù)回收率試驗結(jié)果（n=3）序號待測組分平均回收率（%）第1次提取第2次提取1辣椒玉紅素92.43.42辣椒紅素91.52.7為了驗證不同提取方式對測定結(jié)果的影響，實驗考察了渦旋10min和先渦旋1min再超聲10min提取的回收率情況，結(jié)果見表8。結(jié)果有較為明顯的改善。由于飼料基質(zhì)的復(fù)雜性，提取的難易程度不同，為了實驗整體效果，本方法采用先渦旋1min再超聲10min12為了進(jìn)一步考察提取時間對測定結(jié)果的影響，加入10mL乙腈樣品回收率。結(jié)果見表9。實驗結(jié)果表明，隨著提取時間增加，回收率無明顯增加。為保證不同類型樣品的提取效率，且綜合考慮時表9不同提取時間回收率試驗結(jié)果（n=3）序號待測組分平均回收率（%）5min10min15min1辣椒玉紅素83.485.684.12辣椒紅素81.280.281.7已有的實驗結(jié)果表明，用乙腈提取后的樣品，經(jīng)高速離心后，溶液澄清，透明度好，經(jīng)上機(jī)檢測后，色譜圖比較簡單，雜質(zhì)干擾峰較少，且不影響目標(biāo)物檢測。為了進(jìn)一步考察凈化條件的影響，將乙腈提取后的樣品溶液用QuEChERS方式凈化后，離心，取上清液上機(jī)，所得結(jié)果與乙腈提取后直接離心上機(jī)的結(jié)果相比，回收率損失約為15%～20%，說明凈化過程會引起目標(biāo)物的損失。結(jié)果見表10?；谥苯犹崛∩蠙C(jī)的效果良好，所以本方法采用乙腈提取后表10凈化實驗對回收率的影響（n=3）處理方法平均回收率（%）（100μg/kg）平均回收率（%）（500μg/kg）辣椒玉紅素辣椒紅素辣椒玉紅素辣椒紅素QuEChERS凈化76.764.773.867.6只提取95.082.490.381.3最終確定的樣品提取處理方法如下：稱取試樣2g（精確至0.1（如果粘稠加一顆陶瓷均質(zhì)子超聲10min，于8000r/min離心5min。取0.8mL上清液，加入0.2mL水，渦旋混合均勻。用微孔濾為確保檢測方法的準(zhǔn)確性，依據(jù)目標(biāo)化合物理化性質(zhì)，對其標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液穩(wěn)定性進(jìn)行驗證。將目標(biāo)化合物配制成0.10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，2℃~8℃保存。分別在0天、14天、1個月取出標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稀釋上機(jī)，同時新配標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，用液相色譜儀測定濃度，考察其穩(wěn)定性，結(jié)果見表11。結(jié)果表明，當(dāng)測試時間為1個月時，待測物峰面積穩(wěn)定，無明顯降解和變化。因此為保證標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性，減少測試誤差，并參照GB/T27404-表11標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果測試時間辣椒紅素（mg/mL）辣椒玉紅素（mg/mL）0.100.100.0990.09930天0.0980.097準(zhǔn)確移取辣椒紅素、辣椒玉紅素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，用80%乙腈水溶液逐級稀釋成濃度為0.02g/mL、0.1g/mL、0.2g/mL、色譜儀測定，臨用現(xiàn)配。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測組分的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以待測組分的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，辣椒紅素、辣椒玉紅素線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）結(jié)果見表12。結(jié)果表12標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)序號待測組分線性范圍（ng/mL）2r1辣椒玉紅素20-5000y=133.27x-2.37350.99992辣椒紅素20-5000y=133.27x-2.37350.9989在儀器的最佳條件下，分別取辣椒紅素、辣椒玉紅素混合標(biāo)準(zhǔn)定性測定：以保留時間定性，試樣溶液中辣椒紅素、辣椒玉紅素保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（濃度相當(dāng)）中辣椒紅素、辣椒玉紅定量測定：以辣椒紅素、辣椒玉紅素的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（響應(yīng)值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.99。試樣溶液中待測物的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超在上述色譜條件下，辣椒紅素、辣椒玉紅素的標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色將儀器條件優(yōu)化至最佳，確定方法的檢出限和定量限，具體操添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白樣品中，按照上述確定的方法和條件處理后供高效液相色譜儀測定，結(jié)合稱樣質(zhì)量、提取液體積、凈化和上機(jī)溶液體積等，依據(jù)分析物信噪比S/N>3,確定方法檢出限為0.05mg/kg,依據(jù)分析物信噪比S/N>10,確定方法定量限為0.1根據(jù)信噪比計算得到的定量限進(jìn)行空白基質(zhì)加標(biāo)試驗，結(jié)果見表13~表20。表13蛋雞產(chǎn)蛋期配合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒素Ⅰ97.386.898.296.798.296.55.285.86Ⅱ96.399.798.292.699.14.55Ⅲ96.185.797.185.794.790.591.65.58辣椒紅素Ⅰ96.796.696.298.595.999.05.617.33Ⅱ98.592.999.399.797.498.43.21Ⅲ80.588.797.389.482.391.588.36.97表14蛋雞配合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均批內(nèi)RSD批間RSD辣椒素Ⅰ96.897.496.498.697.2率率98.5（%）（%）Ⅱ99.592.897.498.598.898.74.01Ⅲ86.297.198.498.096.099.695.9辣椒紅素Ⅰ98.797.396.096.897.899.24.695.76Ⅱ99.496.998.799.03.30Ⅲ85.998.386.893.398.491.992.45.84表15蛋鴨配合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒素Ⅰ97.498.099.798.698.799.42.284.18Ⅱ99.896.799.696.496.85.38Ⅲ92.499.996.394.597.897.74.68辣椒紅素Ⅰ98.697.398.698.992.998.33.522.78Ⅱ99.398.396.398.198.199.23.00Ⅲ98.397.296.399.797.898.62.13表16蛋鴨產(chǎn)蛋期配合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均批內(nèi)RSD批間RSD辣椒素Ⅰ99.598.597.296.4（（14.20Ⅱ97.598.796.098.997.398.72.78Ⅲ89.292.095.994.593.597.893.83.21辣椒紅素Ⅰ90.196.697.298.396.696.63.653.06Ⅱ96.797.299.397.499.998.92.32Ⅲ95.492.598.894.597.896.52.95表17寵物（犬）配合飼料添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均率批內(nèi)RSD（%）批間RSD辣椒素Ⅰ97.595.998.198.796.199.04.524.06Ⅱ96.999.396.195.297.498.33.54Ⅲ98.596.688.399.797.198.796.54.32辣椒紅素Ⅰ99.297.098.397.43.955.01Ⅱ97.898.191.798.197.992.095.93.30Ⅲ86.898.292.887.996.696.993.25.24表18寵物（貓）配合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均批內(nèi)RSD批間RSD辣椒素Ⅰ97.896.396.797.195.7率率98.75.69Ⅱ96.890.692.491.194.797.393.83.07Ⅲ89.781.494.398.199.594.392.97.09辣椒紅素Ⅰ96.799.499.695.36.685.87Ⅱ97.292.598.790.889.787.592.74.72Ⅲ92.698.397.997.095.998.396.72.27表19蛋雞預(yù)混合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒素Ⅰ97.199.897.69896.999.33.655.66Ⅱ92.691.198.193.897.15.72Ⅲ81.697.896.998.092.995.293.76.66辣椒紅素Ⅰ98.290.798.298.08.007.45Ⅱ96.498.493.592.697.197.45.13Ⅲ85.189.997.193.697.484.291.26.33表20蛋鴨預(yù)混合飼料定量限加標(biāo)回收試驗結(jié)果添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均批內(nèi)RSD批間RSD辣椒素Ⅰ96.488.297.398.198.1率率97.96.67Ⅱ96.798.997.197.396.098.94.24Ⅲ85.396.582.496.696.691.891.56.88辣椒紅素Ⅰ94.998.397.798.597.698.93.865.27Ⅱ97.788.298.796.187.795.36.50Ⅲ96.491.387.398.993.298.594.34.80結(jié)果表明，辣椒玉紅素平均回收率為91.5%～100%，批內(nèi)變辣椒紅素平均回收率為88.3%～100.9%，批內(nèi)變異系數(shù)為蛋雞配合飼料、蛋鴨配合飼料、蛋鴨產(chǎn)蛋期配合飼料、寵物（犬）配合飼料、寵物（貓）配合飼料、蛋雞預(yù)混合飼料、蛋鴨預(yù)混合飼料分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，每種試樣采用不同的添加濃度，每個添表21蛋雞產(chǎn)蛋期配合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ97.386.898.296.798.296.55.285.86Ⅱ96.399.798.292.699.14.55Ⅲ96.185.797.185.794.790.591.65.58辣椒紅素Ⅰ96.796.696.298.595.999.05.617.33Ⅱ98.592.999.399.797.498.43.21Ⅲ80.588.797.389.482.391.588.36.97500辣椒玉紅素Ⅰ85.989.492.795.688.989.790.43.713.58Ⅱ95.387.290.391.589.289.690.53.02Ⅲ84.487.596.388.589.289.789.34.40辣椒紅素Ⅰ94.389.893.394.490.184.391.04.255.22Ⅱ82.789.293.481.990.994.988.8Ⅲ83.391.788.582.692.495.289.05.75辣椒玉紅素Ⅰ87.893.281.692.289.894.189.85.156.28Ⅱ90.889.792.078.280.584.686.06.70Ⅲ94.089.486.180.186.078.185.66.85辣椒紅素Ⅰ85.581.584.283.888.991.185.84.134.25Ⅱ85.281.392.687.382.788.486.34.76Ⅲ84.990.883.889.289.492.888.53.92表22蛋雞配合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ96.897.496.498.697.298.53.13Ⅱ99.592.897.498.598.898.74.01Ⅲ86.297.198.498.096.099.695.9辣椒紅素Ⅰ98.797.396.096.897.899.24.695.76Ⅱ99.496.998.799.03.30Ⅲ85.998.386.893.398.491.992.45.84500辣椒玉紅素Ⅰ90.395.094.191.784.392.491.34.184.65Ⅱ87.789.588.993.190.989.389.92.09Ⅲ93.978.385.691.894.192.889.47.03辣椒紅素Ⅰ94.487.295.889.194.590.091.83.833.17Ⅱ95.588.295.894.990.393.693.13.34Ⅲ87.590.591.793.394.092.391.62.55辣椒玉紅素Ⅰ80.390.081.592.384.486.985.95.504.31Ⅱ89.681.491.583.982.487.886.14.79Ⅲ86.388.883.987.785.891.287.32.92辣椒紅素Ⅰ81.483.789.488.880.881.984.34.533.94Ⅱ81.880.487.388.185.387.785.13.85Ⅲ85.284.081.780.089.287.684.6表23蛋鴨配合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ97.49899.798.698.799.42.284.18Ⅱ99.896.799.696.496.85.38Ⅲ92.499.996.394.597.897.74.68辣椒紅素Ⅰ98.697.398.698.992.998.33.522.78Ⅱ99.398.396.398.198.199.23.00Ⅲ98.397.296.399.797.898.62.13500辣椒玉紅素Ⅰ89.789.885.196.091.389.290.23.912.99Ⅱ92.495.687.989.492.789.491.2Ⅲ93.692.891.788.489.991.891.42.09辣椒紅素Ⅰ93.584.492.572.982.695.987.09.986.64Ⅱ89.895.894.487.093.994.692.63.69Ⅲ91.191.483.689.995.092.890.64.26辣椒玉紅素Ⅰ90.482.988.189.590.890.288.73.354.77Ⅱ90.684.790.989.981.781.086.55.28Ⅲ80.289.581.788.582.681.884.14.67辣椒紅素Ⅰ89.184.884.889.381.883.185.53.623.93Ⅱ80.787.088.981.488.987.885.84.36Ⅲ80.688.185.488.183.080.084.24.25表24蛋鴨產(chǎn)蛋期配合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ99.598.597.296.43.814.20Ⅱ97.598.796.098.997.398.72.78Ⅲ89.292.095.994.593.597.893.83.21辣椒紅素Ⅰ90.196.697.298.396.696.63.653.06Ⅱ96.797.299.397.499.998.92.32Ⅲ95.492.598.894.597.896.52.95500辣椒玉紅素Ⅰ88.995.787.590.393.395.991.93.873.82Ⅱ91.491.495.290.494.790.792.32.27Ⅲ88.792.085.183.191.490.488.54.08辣椒紅素Ⅰ94.190.393.093.587.394.592.13.023.71Ⅱ95.391.588.194.088.789.591.23.23Ⅲ91.991.083.388.792.084.888.64.24辣椒玉紅素Ⅰ88.582.089.288.386.081.085.84.28Ⅱ89.082.490.586.980.785.485.84.40Ⅲ86.787.782.682.491.392.687.24.88辣椒紅素Ⅰ82.688.681.685.785.486.385.03.004.42Ⅱ80.490.980.085.783.884.084.14.74Ⅲ87.089.184.074.986.284.384.35.87表25寵物（犬）配合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ97.595.998.198.796.199.04.524.06Ⅱ96.999.396.195.297.498.33.54Ⅲ98.596.688.399.797.198.796.54.32辣椒紅素Ⅰ99.297.098.397.43.955.01Ⅱ97.898.191.798.197.992.095.93.30Ⅲ86.898.292.887.996.696.993.25.24500辣椒玉紅素Ⅰ90.192.584.496.988.091.290.54.663.94Ⅱ88.793.688.190.988.482.888.84.03Ⅲ94.488.992.594.190.293.692.32.44辣椒紅素Ⅰ94.493.580.995.782.591.189.75.96Ⅱ90.591.789.794.888.393.791.52.69Ⅲ82.390.382.185.281.882.384.03.96辣椒玉紅素Ⅰ88.786.472.986.787.582.384.17.005.04Ⅱ88.281.091.087.180.185.685.54.95Ⅲ83.580.785.581.888.083.283.8辣椒紅素Ⅰ81.987.189.787.179.988.785.74.584.18Ⅱ89.687.682.780.181.580.083.64.86Ⅲ87.188.787.081.484.982.885.33.29表26寵物（貓）配合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ97.896.396.797.195.798.75.015.69Ⅱ96.890.692.491.194.797.393.83.07Ⅲ89.781.494.398.199.594.392.97.09辣椒紅素Ⅰ96.799.499.695.36.685.87Ⅱ97.292.598.790.889.787.592.74.72Ⅲ92.698.397.997.095.998.396.72.27500辣椒玉紅素Ⅰ92.495.093.493.588.387.991.83.212.93Ⅱ95.492.390.088.793.488.091.33.16Ⅲ93.289.887.288.092.891.190.42.73辣椒紅素Ⅰ87.691.395.092.195.989.691.93.434.15Ⅱ98.189.592.295.395.391.793.73.32Ⅲ96.192.884.392.388.485.589.9辣椒玉紅素Ⅰ90.685.685.090.283.690.587.63.644.20Ⅱ91.984.387.287.082.985.286.43.64Ⅲ89.692.080.682.291.885.186.95.69辣椒紅素Ⅰ86.680.188.386.086.281.184.73.904.39Ⅱ80.891.180.189.886.380.484.85.88Ⅲ83.885.578.285.287.783.083.93.84表27蛋雞預(yù)混合飼料飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ97.199.897.69896.999.33.655.66Ⅱ92.691.198.193.897.15.72Ⅲ81.697.896.998.092.995.293.76.66辣椒紅素Ⅰ98.290.798.298.08.007.45Ⅱ96.498.493.592.697.197.45.13Ⅲ85.189.997.193.697.484.291.26.33500辣椒玉紅素Ⅰ92.491.893.590.197.896.493.77.78Ⅱ88.582.381.590.991.693.688.15.74Ⅲ81.181.971.383.992.482.382.28.20辣椒紅素Ⅰ95.987.592.883.282.383.387.56.504.80Ⅱ94.691.687.988.290.192.490.82.84Ⅲ92.294.685.392.495.191.44.05辣椒玉紅素Ⅰ80.281.391.390.389.892.387.56.104.58Ⅱ86.385.981.489.984.283.385.23.44Ⅲ87.583.582.389.991.288.687.24.07辣椒紅素Ⅰ87.180.986.086.685.480.984.53.353.15Ⅱ82.883.984.288.482.286.684.72.80Ⅲ83.285.983.588.989.982.685.73.64表28蛋鴨預(yù)混合飼料添加回收添加濃度（mg/kg）待測組分批次回收率（%）平均回收率（%）批內(nèi)RSD（%）批間RSD（%）辣椒玉紅素Ⅰ96.488.297.398.198.197.96.816.67Ⅱ96.798.997.197.396.098.94.24Ⅲ85.396.582.496.696.691.891.56.88辣椒紅素Ⅰ94.998.397.798.597.698.93.865.27Ⅱ97.788.298.796.187.795.36.50Ⅲ96.491.387.398.993.298.594.34.80500辣椒玉紅素Ⅰ89.987.487.893.688.894.890.43.433.46Ⅱ94.694.187.988.593.190.591.53.16Ⅲ95.195.590.587.287.794.791.84.15辣椒紅素Ⅰ89.187.987.187.288.394.289.03.00Ⅱ87.693.795.593.182.691.490.75.26Ⅲ91.795.590.896.088.594.592.83.20辣椒玉紅素Ⅰ84.782.187.792.388.491.887.84.524.43Ⅱ91.683.484.987.091.592.188.44.31Ⅲ84.983.481.288.490.582.585.24.23辣椒紅素Ⅰ89.782.080.081.382.783.783.24.09Ⅱ84.183.189.982.589.081.685.04.15Ⅲ88.980.987.288.789.184.186.53.83紅素平均回收率為81.6%～100.9%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.13%~9.98%,批間變異系數(shù)為2.78%～7.45%;本方法準(zhǔn)確度和精密度良好。不同空白基質(zhì)加標(biāo)試驗色譜圖詳見圖6~圖21。圖6產(chǎn)蛋鴨預(yù)混合飼料空白圖7產(chǎn)蛋鴨預(yù)混合飼料加標(biāo)回收圖8產(chǎn)蛋雞預(yù)混合飼料空白圖9產(chǎn)蛋雞預(yù)混合飼料加標(biāo)回收圖10蛋鴨配合飼料空白圖11蛋鴨配合飼料加標(biāo)回收圖12產(chǎn)蛋鴨配合飼料空白圖13產(chǎn)蛋鴨配合飼料加標(biāo)回收圖14蛋雞產(chǎn)蛋期配合飼料空白圖16蛋雞產(chǎn)蛋期配合飼料2號空白圖17蛋雞產(chǎn)蛋期配合飼料2號加標(biāo)回收圖18寵物(犬)配合飼料空白圖19寵物(犬)配合飼料加標(biāo)回收圖20寵物(貓)配合飼料空白圖21寵物(貓)配合飼料加標(biāo)回收在上述色譜條件下，考察其他類胡蘿卜素對分析辣椒紅素和辣椒玉紅素的干擾情況。選擇一種市售的飼料添加劑類胡蘿卜素產(chǎn)品進(jìn)行干擾試驗。其中，辣椒紅素的標(biāo)識含量為≥5g/kg。在上述液相色譜條件下，其他類胡蘿卜素的出峰時間均對辣椒紅素和辣椒玉紅素的響應(yīng)無干擾，見圖22,且測得的辣椒紅素的含量為5.86g/kg,圖22干擾試驗液相色譜圖試驗收集蛋鴨配合飼料、蛋雞配合飼料、肉雞配合飼料、肉鴨配合飼料、豬配合飼料、雞濃縮飼料、鴨濃縮飼料、雞復(fù)合預(yù)混合飼料、鴨復(fù)合預(yù)混合飼料、貓糧、犬糧、魚配合飼料等12種飼料產(chǎn)品，按上述確定的樣品提取方法條件和色譜條件測定試樣中辣椒紅飼料樣品種類繁多，添加的各種化學(xué)物質(zhì)范圍廣，本實驗部分僅對常見的飼料產(chǎn)品進(jìn)行了驗證，不同基質(zhì)樣品類型的檢測可能會出現(xiàn)不同程度的偏差。依據(jù)本試驗測定的回收率、精密度，并參照在重復(fù)性條件下，兩次獨立測定結(jié)果與其算術(shù)平均值的絕對差三、試驗驗證的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟(jì)論證，預(yù)期的經(jīng)