分子細(xì)胞生物學(xué)-細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)李蓮軍博士云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2003.9-2021.9生命科學(xué)是實(shí)驗(yàn)科學(xué)，它的很多成果都是通過實(shí)驗(yàn)才得以發(fā)現(xiàn)和開展的。許多細(xì)胞生物學(xué)的重要進(jìn)展以及新概念的形成，往往來自新技術(shù)的應(yīng)用。因此，方法上的突破，對(duì)于理論和應(yīng)用上的開展具有巨大的推動(dòng)作用。第一節(jié)顯微鏡技術(shù)第二節(jié)細(xì)胞成分分析技術(shù)第三節(jié)細(xì)胞組分別離技術(shù)第四節(jié)細(xì)胞分選技術(shù)第五節(jié)細(xì)胞工程技術(shù)第六節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)學(xué)習(xí)內(nèi)容一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)(lightmicroscopy)第一節(jié)顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)(electronmicroscopy)觀察細(xì)胞及其組分的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。顯微鏡成像三要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)一、顯微鏡成像根本原理在光學(xué)顯微鏡中，照明系統(tǒng)是可見光，使用的是玻璃透鏡系統(tǒng)，可直接通過目鏡觀察鏡像。在電子顯微鏡中，照明系統(tǒng)為電子束，使用電磁透鏡，通過熒光屏觀察樣品的鏡像。0.61λ分辨率DN.sinα/2=λ:

光源波長(zhǎng);α:物鏡鏡口角;N:介質(zhì)折射率顯微鏡的分辨能力肉眼：0.2mm;光鏡：0.2um;電鏡：0.2nm二、常用光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡倒置顯微鏡(invertedmicroscope)熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)相差顯微鏡(phase-contrastmicroscope)微分干預(yù)相差顯微鏡(differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC)暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)激光共焦掃描顯微鏡(laserconfocalmicroscope)倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計(jì)，尤其是光學(xué)系統(tǒng)，將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，主要用于觀察體外培養(yǎng)中活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線光源，用于觀察細(xì)胞中有自發(fā)熒光、誘發(fā)熒光或經(jīng)熒光染料標(biāo)記的結(jié)構(gòu)。熒光顯微鏡特點(diǎn)是：a光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡；b有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。微分干預(yù)顯微鏡偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)的聚光鏡中央有當(dāng)光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，不分辨內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造，適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等?？蓪?duì)細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，可進(jìn)行一系列亞細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)和功能研究。激光共聚焦掃描顯微鏡掃描電子顯微鏡

Scanningelectronmicroscopy，SEM透射電子顯微鏡

Transmissionelectronmicroscopy，TEM三、電子顯微鏡電子顯微鏡觀察到的結(jié)構(gòu)稱超(亞)微結(jié)構(gòu)，可放大幾萬(wàn)倍至幾十萬(wàn)倍。掃描隧道顯微鏡

Scanningtunnelingmicroscope，STM觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，分辨率0.2nm。用電子束穿透標(biāo)本，經(jīng)電磁場(chǎng)的會(huì)聚和放大后在熒光屏上顯像或?qū)⒂跋裢渡涞秸障嗟灼?。由于電子束穿透力弱，故?jīng)固定后的電鏡標(biāo)本需制成超薄切片(50～80nm)，并用重金屬鹽如檸檬酸鉛和醋酸鈾等染色。標(biāo)本制備：①固定(戊二醛等)②包埋(環(huán)氧樹脂)③切片(50-80nm)④染色(醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬鹽)。透射電鏡術(shù)掃描電鏡術(shù)用于觀察細(xì)胞外表的立體細(xì)微結(jié)構(gòu)。需將小塊組織經(jīng)固定、脫水、枯燥后，在其外表噴鍍薄層碳膜或金屬膜。圖像清晰，富有立體感。儀器設(shè)備使用本卷須知使用前必須認(rèn)真閱讀“說明書〞，了解其工作原理和性能，按照“說明書〞的要求進(jìn)行操作，或在技術(shù)人員的指導(dǎo)下操作。第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法

一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)三、核酸雜交技術(shù)四、放射自顯影技術(shù)一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù)主要用于顯示細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等。利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。如用過碘酸—Schiff反響檢測(cè)多糖，用脂溶性染料顯示脂類，用酶化學(xué)染色顯示某種酶，用孚爾根反響顯示DNA。二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)原理，采用標(biāo)記的抗原或抗體，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合，然后用顯微鏡觀察標(biāo)記物，顯示細(xì)胞內(nèi)的抗體或抗原(肽或蛋白質(zhì)等)的分布部位及相對(duì)含量。常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶、熒光素等，因此又可分為免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等。二種根本染色法直接法：第一抗體被標(biāo)記。間接法：第一抗體也被看作抗原，而第二抗體被標(biāo)記。由于信號(hào)被放大，故靈敏度更高。是用標(biāo)記的RNA或DNA探針檢測(cè)RNA或DNA片段的有無、及在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)基因的活性(mRNA)的一種重要方法。三、核酸分子雜交技術(shù)原理：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)某一基因在染色體上的定位，稱染色體原位雜交。用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)某一基因或轉(zhuǎn)錄物mRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)錄狀況，稱細(xì)胞原位雜交。原位雜交技術(shù)Southern

雜交是體外分析特異DNA序列的方法。操作時(shí)先用限制性內(nèi)切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經(jīng)凝膠電泳別離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用標(biāo)記的探針雜交，即可識(shí)別出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。四、放射自顯影術(shù)

放射自顯影術(shù)(radioautography,autoradiography)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、變化、作用機(jī)理、作用部位等等。其原理是將放射性同位素標(biāo)記物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時(shí)間后，進(jìn)行制片、放射性曝光、顯影、定影等處理，即得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量。放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對(duì)標(biāo)記上放射性的化合物進(jìn)行定位或相對(duì)定量測(cè)定。第三節(jié)細(xì)胞成分的別離技術(shù)別離技術(shù)是一大類技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的別離和生物大分子的別離。一、離心別離技術(shù)(centrifugation)二、層析別離技術(shù)(chromatography)

一、離心別離技術(shù)離心別離細(xì)胞組分和生物分子是最常用的別離方法，因?yàn)椴煌募?xì)胞器和生物分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降別離。常用的兩類離心別離方法：差速離心(differentialcentrifugation)密度梯度離心(densitygradientcentrifugation)細(xì)胞器及大分子的密度及其沉降系數(shù)不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)別離所需的離心力結(jié)構(gòu)離心力細(xì)胞核800-1000g線粒體20，000-30，000g葉綠體20，000-30，000g溶酶體20，000-30，000g微體20，000-30，000g粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)50，000-80，000g質(zhì)膜和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)80，000-100，000g游離核糖體、病毒粒子150，000-300，000g差速離心在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于別離不同大小的細(xì)胞器。在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，差速離心只用于別離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于別離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步別離，常需再通過密度梯度離心進(jìn)一步別離純化。密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一個(gè)連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞器分層、別離。又可分為速度沉降和等密度沉降兩種。速度沉降(velocitysedimentation)主要用于別離密度相近而大小不等的細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被別離生物顆粒的最小密度。生物顆粒(細(xì)胞器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而到達(dá)別離。速度沉降等密度沉降(isopycnicsedimentation)適用于別離密度不等的顆粒。細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長(zhǎng)時(shí)間那么沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里到達(dá)平衡，從而將不同密度的細(xì)胞器別離。等密度沉降二、層析別離技術(shù)層析是廣泛使用的別離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計(jì)的物理別離方法。①凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)②離子交換層析(ion-exchangechromatography)③親和層析(affinitychromatography)凝膠過濾層析又稱排阻層析或分子篩過濾，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行別離和純化的一種方法。原理：蛋白質(zhì)的體積大小不一，凝膠上有大小不一的孔；大的蛋白質(zhì)在凝膠中不進(jìn)入孔內(nèi)直接下來，速度最快，中等大小的進(jìn)入大孔中，下來速度較慢，小的蛋白質(zhì)那么進(jìn)入小孔中，下來速度最慢。離子交換層析離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進(jìn)行別離純化的一種方法。它以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組別離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差異而進(jìn)行別離的一種層析方法。

在生物分子中，有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識(shí)別并結(jié)合，如酶與底物的識(shí)別結(jié)合、受體與配體的識(shí)別結(jié)合、抗體與抗原的識(shí)別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可使這種結(jié)合解除，生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)別離純化方法親和層析一、離心分選術(shù)二、流式細(xì)胞分選術(shù)三、免疫磁珠分選術(shù)四、電泳分選術(shù)第四節(jié)細(xì)胞分選技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個(gè)細(xì)胞的液滴，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測(cè)器檢測(cè)，轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，送入計(jì)算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，別離純度可達(dá)99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(jì)(儀)(flowcytometer)。二、流式細(xì)胞術(shù)三、免疫磁珠法磁珠可以結(jié)合蛋白質(zhì)，也可以被磁鐵吸引而發(fā)生力學(xué)移動(dòng)。將微小磁珠用抗體(或抗原)包被后，使之與溶液中目的細(xì)胞外表的抗原(或抗體)特異性結(jié)合，再通過磁力作用發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，從而到達(dá)目的細(xì)胞與其他細(xì)胞(或物質(zhì))別離。四、細(xì)胞電泳在一定pH值下細(xì)胞外表帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場(chǎng)的作用下發(fā)生泳動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳(cellelectrophoresis)。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞電荷量有所不同，故在一定的電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同，可用來別離不同種類的細(xì)胞。所謂細(xì)胞工程，就是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行操作。第五節(jié)細(xì)胞工程技術(shù)細(xì)胞工程根本技術(shù)主要包括：細(xì)胞體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞器移植及基因轉(zhuǎn)移等。一、細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)二、細(xì)胞融合及單抗技術(shù)三、顯微操作技術(shù)四、干細(xì)胞技術(shù)將離體細(xì)胞或組織放置在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其能生長(zhǎng)并增殖的一種技術(shù)。用于檢測(cè)各種理化因子、細(xì)胞因子等對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖、分化、代謝、運(yùn)動(dòng)、吞噬、分泌等生命活動(dòng)的影響，還可用于研究細(xì)胞癌變及逆轉(zhuǎn)的機(jī)制，也可用于獲取特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)物等等。一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、細(xì)胞融合技術(shù)通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合(cellfusion)或細(xì)胞雜交。相同基因型細(xì)胞融合成同核體(homokaryon)；不同基因型的雜交細(xì)胞那么稱為異核體(heterokaryon)。動(dòng)物細(xì)胞融合有以下三條途徑：1.病毒誘導(dǎo)融合；2.化學(xué)誘導(dǎo)融合；3.電激誘導(dǎo)融合。單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體(monocloneantibody)技術(shù)是細(xì)胞雜交技術(shù)的成功應(yīng)用。正常淋巴細(xì)胞(如小鼠脾細(xì)胞)具有分泌抗體的能力，但不能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞(如骨髓瘤)可以在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，但不分泌抗體。1975英國(guó)人Kohler和Milstein將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎(jiǎng)。單克隆抗體制備流程用特異抗原免疫小鼠(BALB/c)取脾臟漿細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合篩選雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體三、顯微操作技術(shù)在顯微鏡下，用顯微操作儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖手術(shù)和微量注射的技術(shù)屬顯微操作技術(shù)。包括細(xì)胞核移植、嵌合體制作、細(xì)胞器移植、基因或染色體注入、胚胎切割、體外胚胎生產(chǎn)等。1核移植(克隆動(dòng)物)技術(shù)細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過受精等有性過程(無性繁殖)即可被激活，構(gòu)成新的重組胚胎，重組胚胎移植后，發(fā)育成與供體細(xì)胞基因型相同的后代，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。

嵌合體(chimeras)是指由不同基因型細(xì)胞構(gòu)成的生物體。嵌合動(dòng)物是指由兩種或兩種以上具有不同遺傳性質(zhì)的細(xì)胞系組成的聚合胚發(fā)育成的動(dòng)物個(gè)體。嵌合動(dòng)物技術(shù)是指由兩個(gè)或兩個(gè)以上同種或異種的受精卵組合發(fā)育而來的一個(gè)復(fù)合個(gè)體的制作技術(shù)。制作嵌合動(dòng)物的方法主要有聚合法和囊胚注射法。2嵌合動(dòng)物技術(shù)

聚合法是將2個(gè)或多個(gè)去除透明帶的早期胚胎，簡(jiǎn)單地聚合在一起培養(yǎng)形成一個(gè)嵌合胚胎的過程。

囊胚注射法是把細(xì)胞注射入囊胚腔中，囊胚經(jīng)培養(yǎng)進(jìn)一步發(fā)育形成一個(gè)嵌合胚胎的過程。注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、ES細(xì)胞和EG細(xì)胞，甚至是已分化的細(xì)胞。3染色體操作技術(shù)按照人們的意圖，有方案地削減、添加和替換染色體或其某一局部的方法和技術(shù)，以改變生物的遺傳根底，到達(dá)人類需要的目的。四、干細(xì)胞技術(shù)干細(xì)胞是一類能自我更新和分化為特殊種類細(xì)胞的細(xì)胞。干細(xì)胞被?SCIENCE?1999，2000及2003年評(píng)為“十大科技進(jìn)展之一〞。干細(xì)胞技術(shù)主要包括：建立干細(xì)胞系，體外誘導(dǎo)分化，遺傳改造，移植、體外構(gòu)建組織和器官等。干細(xì)胞分類胚胎性干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞ESs、胚胎生殖細(xì)胞EGs組織特異性干細(xì)胞：造血干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、全能干細(xì)胞：受精卵、卵裂球?qū)Ｄ芨杉?xì)胞：造血干細(xì)胞,精原干細(xì)胞,皮膚干細(xì)胞多能干細(xì)胞：ESs、EGs；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞按來源劃分按分化潛能劃分第五節(jié)分子生物學(xué)技術(shù)一、PCR技術(shù)二、基因工程技術(shù)三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)一、PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒错?polymerasechainreaction,PCR)用于在體外將微量的目標(biāo)DNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，以便進(jìn)一步分析或操作。反響體系：①樣品DNA；②引物(primer)；③4種dNTP；④TagDNA聚合酶；⑤適宜的緩沖體系和適量的Mg2+。反響過程：①變性；②復(fù)性