章常用分子生物學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第二十章第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理復(fù)性RNADNA（一）印跡技術(shù)利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”，譯為印跡技術(shù)。用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”，探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。（二）探針技術(shù)二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡

(Southernblotting)（二）RNA印跡(Northernblotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡

(Westernblotting)用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。

用于RNA的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。其他：斑點印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實驗①②③放射自顯影照片DNA芯片技術(shù)第二節(jié)PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology1.什么是PCR?PCR(PolymeraseChainReaction)isaninvitromethodofDNAsynthesisbywhichaparticularfragmentofDNAcanbespecificallyamplified.2PCR的背景知識DNA復(fù)制

DNA變性和復(fù)性&雜交DNAReplication

5’

3’dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3’TemplatePrimer5’

DNAReplication3’加熱退火DNA變性&復(fù)性變性復(fù)性雜交5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

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TemplateDNA3PCR技術(shù)的工作原理5

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Cycle35

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25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。PCR技術(shù)原理示意圖PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

PCR體系基本組成成分試述PCR的工作原理及基本反應(yīng)步驟工作原理：以待擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5’末端和3’末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制，沿著模板鏈延伸合成新的DNA鏈，即可使目的DNA片段得到上百萬倍的擴增。基本反應(yīng)步驟：見習(xí)題集4PCR的特點高敏感性高特異性操作簡單且快速

應(yīng)用廣泛PCRTargetDNADNA高敏感性HBVHAVHDVHCVPCRHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBVHBV高特異性PCR技術(shù)的主要用途（一）目的基因的克隆前提條件：已知待擴增目的基因或DNA片段兩端的序列（二）基因突變利用PCR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。（三）DNA和RNA的微量分析PCR技術(shù)高度敏感，對模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。將PCR技術(shù)引入DNA序列測定，使測序工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測DNA片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。（四）DNA序列測定（五）基因突變分析逆轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)?？俁NA的提取cDNA的合成目的基因的擴增RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分析的最有效方法。（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)幾種重要的PCR衍生技術(shù)RTPCR原位PCR(insituPCR)是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或RNA是否在該組織或細胞中存在。原位PCR方法彌補了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。（二）原位PCR技術(shù)（三）實時PCR技術(shù)實時PCR(real-timePCR)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。實時PCR技術(shù)原理QR3'3'5'5'上游引物下游引物熒光雙標(biāo)記探針RQ3'3'5'5'5’3’實時PCR分為非探針類和探針類實時PCR實時PRC非探針類探針類1.TaqMan探針法2.分子信標(biāo)探針法3.FRET探針法

TaqMan探針法實時PCR原理示意圖R:熒光報告基團Q:熒光淬滅基團第三節(jié)基因文庫GeneLibrary基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)基因文庫(genelibrary)是指一個包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。一、基因組DNA文庫基因組DNA文庫是指生物的基因組DNA的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。用于構(gòu)建基因組文庫的載體有

噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等?；蚪M文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。二、cDNA文庫第四節(jié)生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnique是指將許多特定的DNA片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標(biāo)記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)基因芯片工作流程示意圖是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)蛋白質(zhì)芯片作用原理第五節(jié)生物大分子相互作用研究技術(shù)

TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交各種親和分析（標(biāo)簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析噬菌體顯示系統(tǒng)篩選常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標(biāo)簽蛋白沉淀標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。標(biāo)簽融合蛋白沉淀實驗流程示意圖（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成為“誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的“獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。電泳遷移率變動測定(electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗(gelshiftassay)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定RNA序列間的相互作用