【課件】重組DNA技術(shù)的基本工具 2023-2024學年高二下學期生物人教版選擇性必修3

第3章基因工程第1節(jié)重組DNA技術(shù)的基本工具提取抗蟲基因棉花細胞蘇云金芽孢桿菌(有抗蟲特征)

普通棉花

(無抗蟲特征)與載體DNA拼接，導入(含抗蟲基因)

棉花植株(有抗蟲特征)培育抗蟲棉的簡要過程基因工程實例：基因工程的概念：

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫重組DNA技術(shù)。1.別名：2.原理：3.操作對象：4.操作水平：5.結(jié)果：重組DNA技術(shù)基因分子水平基因重組賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物制品1、不同生物的基因為什么能拼接？2、外源基因為什么能在受體細胞中表達？思考-討論(1)DNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸。(2)雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)。(1)基因是控制生物性狀的獨立遺傳單位。(2)遺傳信息的傳遞都遵循中心法則。(3)生物界共用一套遺傳密碼。相同的遺傳信息在

不同的生物體內(nèi)表達出相同的蛋白質(zhì)。基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

“工欲善其事，必先利其器”。在培育轉(zhuǎn)基因番木瓜時，既要在體外對含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要將重組DNA分子導入番木瓜體內(nèi)，并使其表達。DNA分子極小，實現(xiàn)這些精確操作需要哪些“分子工具”呢？從社會中來

番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W家通過精心設(shè)計，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。

DNA雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細的工作，更需要專門的“分子工具”。那么，科學家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？轉(zhuǎn)基因番木瓜(左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜(右）工具分子手術(shù)刀分子縫合針分子運輸車限制性內(nèi)切核酸酶：DNA連接酶：載體：準確切割DNA分子將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞培育轉(zhuǎn)基因番木瓜“分子手術(shù)刀”準確切割DNA分子“分子縫合針”“分子運輸車”將DNA片段連接起來將體外重組好的DNA分子導入受體細胞一、限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”1.簡稱：限制酶2.來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。3.作用：

識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。4.作用部位：特定部位的磷酸二酯鍵ATCGTAGC5’3’5’3’磷酸二酯鍵5.識別序列：

大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。EcoRⅠ5’…G-A-A-T-T-C…3’3’…C-T-T-A-A-G…5’SmaⅠ5’…C-C-C-G-G-G…3’3’…G-G-G-C-C-C…5’6.限制酶的命名：

用生物屬名的頭一個字母與種加詞的頭兩個字母，組成了3個字母的略語，以此來表示這個酶是從哪種生物中分離出來的。例如，一種限制酶是從大腸桿菌(Escherichiacoli)的R型菌株分離來的，就用字母EcoR表示；如果它是從大腸桿菌R型菌株中分離出來的第一種限制酶，則進一步表示成EcoRI。7.切割結(jié)果：DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式——_________和_______黏性末端平末端當限制酶在它識別序列的___________將DNA分子的兩條鏈分別切開時，產(chǎn)生的是__________；當限制酶在它識別序列的_________切開時，產(chǎn)生的是______；中軸線兩側(cè)黏性末端中軸線處平末端黏性末端黏性末端2024/1/22

實例1—EcoRⅠ限制酶：

識別序列為GAATTC，

切割部位為GA之間的磷酸二酯鍵。

實例2——SmaⅠ限制酶：

識別序列為CCCGGG

切割部位為CG之間的磷酸二酯鍵。形成黏性末端平末端形成平末端課堂練習：寫出下列限制酶切割形成的黏性末端BamHⅠ____EcoRⅠ___HindⅢ___BglⅡ___GATCAATTAGCTGATC思考：你從中發(fā)現(xiàn)什么現(xiàn)象了？不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端你能根據(jù)所掌握的知識，推測限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么嗎？

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制。限制酶就是它的一種防御性工具。當外源DNA入侵時，它會利用限制酶來切割外源DNA，使之失效，以保證自身安全。

所以，簡單來說：限制酶在原核生物中起到的作用為：

切割外源DNA、使之失效，以保證自身安全試推測限制酶為什么不會切割自身的DNA？原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已被修飾二、分子縫合針—DNA連接酶1.作用：將兩個DNA片段連接起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。G

C

TT

AA

AA

TT

C

GGCTTAA

AA

TT

C

GDNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶種類DNA聚合酶DNA連接酶不同點作用實質(zhì)作用結(jié)果模板相同點催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵催化兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵催化形成與模板鏈互補的DNA鏈，形成新的雙鏈DNA分子催化具有互補黏性末端或平末端的DNA片段連接起來，形成重組DNA分子需要不需要①化學本質(zhì)都是蛋白質(zhì)②都是催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶和DNA聚合酶功能比較2.分類：種類E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶來源功能特性相同點大腸桿菌T4噬菌體只能將具有互補黏性末端的DNA片段連接起來，不能連接具有平末端的DNA片段既可以連接雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以連接雙鏈DNA片段的平末端（但連接平末端的效率相對較低）恢復的都是磷酸二酯鍵三、基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”1.作用：將外源基因送入受體細胞2.種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等。種類用途不同點質(zhì)粒、噬菌體植物病毒動物病毒將外源基因?qū)氪竽c桿菌等受體細胞將外源基因?qū)胫参锛毎麑⑼庠椿驅(qū)雱游锛毎麃碓床煌?，在大小、結(jié)構(gòu)、復制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差別3.作為載體需具備的條件（1）有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段（基因）插入其中。（2）能在細胞中進行自我復制或整合到受體DNA上，隨受體DNA同步復制。（3）常有特殊的標記基因（如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等），便于重組DNA分子的篩選。利用標記基因進行篩選示例：4.最常用的運載體——質(zhì)粒（1）質(zhì)粒的化學本質(zhì)：質(zhì)粒是一種____的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于______________或_______________之外，并具有自我復制能力的____________分子裸露真核細胞細胞核原核細胞擬核DNA環(huán)狀雙鏈DNA（2）基因工程中使用質(zhì)粒的特點：

在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行過_________的；這些質(zhì)粒上常有特殊的標記基因，便于__________________；人工改造重組DNA分子的篩選重組DNA分子…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG重組DNA分子1.剪刀和透明膠條分別代表哪種“分子工具”？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對?如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對，可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。DNA的粗提取與鑒定1.實驗原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍色。DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學性質(zhì)方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當?shù)奈锢砘蚧瘜W方法去除其他成分，對DNA進行提取。DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等

不能選擇哺乳動物成熟的紅細胞，因為哺乳動物成熟的紅細胞中沒有細胞核和線粒體，幾乎不含DNA二、材料用具1.選材：注意：2.試劑：①研磨液②體積分數(shù)為95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺試劑⑤蒸餾水含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用三、方法步驟：取材、研磨過濾或離心取上清液預冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNANaCl溶液溶解DNA并鑒定

抑制核酸水解酶的活性，進而抑制DNA降解；抑制DNA分子運動，使DNA易形成沉淀析出；1.取材、研磨：

稱取30g洋蔥，切碎，然后放入研缽中，倒入10mL

研磨液，充分研磨研磨的目的：破碎細胞，使核物質(zhì)容易溶解在研磨液中2.過濾或離心取上清液：

在漏斗中墊上紗布，將洋蔥研磨液過濾到燒杯中，在4℃冰箱中放置幾分鐘后，再取上清液。

也可直接將研磨液倒入塑料離心管中，1500r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，再取上清液放入燒杯中。①上清液中除DNA之外，可能含有哪些雜質(zhì)？可能含有核蛋白、多糖等雜質(zhì)②低溫放置幾分鐘的作用：3.預冷酒精析出DNA或離心收集沉淀中的DNA

在上清液中加入體積相等的、預冷的酒精溶液(體積分數(shù)為95%)，靜置2-3min，溶液中出現(xiàn)的白色絲狀物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸去上面的水分；

或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中，在10000r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清液，將管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。攪拌時應(yīng)輕緩、并沿一個方向：減少DNA斷裂，以便獲得較完整的DNA分子4.NaCl溶液溶解DNA并鑒定

取兩支20mL的試管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。將絲狀物或沉淀物溶于其中一支試管的NaCI溶液中。向兩支試管中各加入4mL的二苯胺試劑?；旌暇鶆蚝?，將試管置于沸水中加熱5min。待試管冷卻后，比較兩支試管中溶液顏色的變化。實驗組對照組水浴加熱結(jié)果分析與評價1.你提取出白色絲狀物或沉淀物了嗎？用二苯胺試劑鑒定的結(jié)果如何？

觀察提取的DNA的顏色，如果不是白色絲狀物，說明DNA中的雜質(zhì)較多。二苯