中藥指紋圖譜的原理與應(yīng)用

中藥指紋圖譜的原理與應(yīng)用

2001級藥學(xué)院李勇沈全妃沈林強(qiáng)朱建波喬洪翔方亮江周虹1整理課件ppt中藥指紋圖譜，即中藥身份證，主要指中藥化學(xué)指紋圖譜，實(shí)際上是一種保證中藥質(zhì)量的措施，是指對某種中藥材或中成藥等運(yùn)用現(xiàn)代分離分析科學(xué)的手段，得到能夠標(biāo)示該中藥的色譜或光譜的圖譜，最終用來對中藥質(zhì)量評價(jià)的科學(xué)性方式。它有兩個(gè)顯著特點(diǎn)，一是通過指紋圖譜的特征性，能有效鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地。二是通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量的相對一致。

2整理課件ppt3整理課件ppt中藥指紋圖譜借用DNA指紋圖譜發(fā)展而來，最先發(fā)展起來的是中藥色譜指紋圖譜。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的，可量化的色譜鑒定手段[2]。借以鑒別真?zhèn)危u價(jià)原料藥材、半成品和成品質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性。其基本屬性是“整體性”和“模糊性”。

4整理課件ppt中藥指紋圖譜按應(yīng)用對象分類，根據(jù)中藥指紋圖譜可用于中藥制劑研究、生產(chǎn)過程的各個(gè)階段，可分為中藥材(原料藥材)指紋圖譜、中藥原料藥(包括飲片、配伍顆粒)指紋圖譜和中藥制劑指紋圖譜。如分得更細(xì)，還可包括用于工藝生產(chǎn)過程中間產(chǎn)物的指紋圖譜。兩種中藥原料藥指紋圖譜應(yīng)區(qū)別對待。對中藥飲片指紋圖譜的要求基本和中藥材指紋圖譜相同。對中藥配伍顆粒(包括標(biāo)準(zhǔn)提取物)指紋圖譜應(yīng)要求高一點(diǎn)

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5整理課件ppt

中藥指紋圖譜按測定手段可分為中藥化學(xué)(成分)指紋圖譜和中藥生物指紋圖譜。中藥化學(xué)(成分)指紋圖譜系指采用光譜、色譜和其他分析方法建立的用以表征中藥化學(xué)成分的特征的指紋圖譜。光譜最常用的是紅外光譜(IR)。色譜最常用的是薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)和毛細(xì)管電泳(CE)。其他方法包括波譜和聯(lián)用技術(shù)。中藥化學(xué)指紋圖譜首推色譜方法和聯(lián)用技術(shù)。TLC法簡便易行，但提供信息量有限，很難反映幾十種、上百種化學(xué)成分組成的復(fù)雜體系。GC適用于揮發(fā)性化學(xué)成分。HPLC適用于非揮發(fā)性成分，中藥中大部分化學(xué)成分均可用HPLC法得出良好的指紋圖譜。CE適用于大部分化學(xué)成分，特別是生物大分子——肽和蛋白的分離，但其重現(xiàn)性有待提高。

6整理課件ppt聯(lián)用技術(shù)是最有效的建立指紋圖譜的方法，如GC/MS，HPLC/MS，HPLC/MS/MS等可大量提供各種信息，符合解決中藥復(fù)雜體系的要求，但儀器價(jià)格昂貴。不易推廣使用。總之，目前使用最多的中藥化學(xué)指紋圖譜是用HPLC方法。中藥生物指紋圖譜包括中藥材DNA指紋圖譜和研究中的中藥基因組學(xué)指紋圖譜、中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜。中藥基因組學(xué)圖譜和中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜系指用中藥制劑作用于某特定細(xì)胞或動物后，引起的基因和蛋白的復(fù)雜的變化情況，這2種指紋圖譜似可稱為生物活性指紋圖譜。目前而言，最主要和常用的是中藥化學(xué)指紋圖譜，特別是中藥HPLC指紋圖譜。

7整理課件ppt下面，對各種指紋圖譜分門別類加以介紹。

8整理課件ppt薄層色譜(TLC)由于操作簡單，展開劑組成靈活多樣，色譜后衍生方便，可以提供色彩斑瀾的彩色圖像，直觀易辨，在中藥鑒別中應(yīng)用頻率最高。采用合格材料和標(biāo)準(zhǔn)操作，可得到高質(zhì)量的色譜圖像，于同板同時(shí)比較鑒別多個(gè)樣品，配合數(shù)碼成像和數(shù)據(jù)處理，還可瞬間形成輪廓圖譜，并給出各峰積分值，加大信息量，從而提高綜合分析能力，比較適合原料藥材指紋圖像分析。由于薄層色譜法是一種開放系統(tǒng)，外界影響因素較多，必然會增加實(shí)驗(yàn)的難度。

9整理課件ppt氣相色譜(GC)以氣體為流動相，對于含揮發(fā)性成分中藥的鑒別具有一定優(yōu)勢。由于裂解氣相色譜具有操作簡便、樣品無須化學(xué)前處理、提供信息量大等優(yōu)點(diǎn)而格外引人注目。該方法將樣品故人裂解器內(nèi)，在一定的條件下將樣品加熱使其瞬間裂解，生成可揮發(fā)性的小分子物質(zhì)，立即被載氣帶人氣相色譜系統(tǒng)的分析柱上，分離后得到具有指紋性質(zhì)的裂解氣相色譜圖。如果將氣相色譜與質(zhì)譜、傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用，則不但可以知道不同中藥中揮發(fā)性成分的差別，而且可以對這些成分進(jìn)行鑒定。

10整理課件ppt高效液相色譜(HPLC)

具有分離效能高、分析速度快、靈敏度高、方法重現(xiàn)性好、選擇性高、適用的樣品類型廣泛等特點(diǎn)。已經(jīng)普遍應(yīng)用于中藥材及制劑的分析檢測，特別是三維高效液相色譜法，近年來發(fā)展很快，非常適合構(gòu)建中藥指紋圖譜。與薄層色譜相比，它是封閉系統(tǒng)色譜，受外界影響小，色譜穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，其分離、鑒別能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于薄層色譜。在中藥指紋圖譜中首推高效液相色譜指紋圖譜。HPLC所分析的中藥中，有相當(dāng)部分為次生代謝產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物的組成和含量不僅和藥材本身的種屬有關(guān)，同時(shí)還與植物后天所處的地域環(huán)境、生長條件、采摘時(shí)間和炮制方法有很大的關(guān)系。對于中成藥來說，與產(chǎn)品的加工過程也有很大的聯(lián)系。不同的加工過程與方法都將對所得的指紋圖譜有相當(dāng)影響，表現(xiàn)在峰高、峰面積、保留時(shí)間以及峰數(shù)量上的變化等。因此，HPLC不僅可以用來對生藥的真?zhèn)巍?yōu)劣進(jìn)行鑒定，同時(shí)還可以對中藥的加工過程進(jìn)行監(jiān)測，可以有效地分析鑒定經(jīng)過不同的炮制、加工的中成藥。

11整理課件ppt高速逆流色譜指紋圖譜(HSCCCfingerprintspectrum，即調(diào)整逆流色譜法)

HSCCC利用動態(tài)液-液分配原理分離樣品，其分離度和重現(xiàn)性與HPLC類似，但樣品前處理簡單。具體地說它是一種基于液-液多級逆流萃取建立的色譜體系，以輕巧的聚四氟乙烯螺旋管作分離柱，在行星式運(yùn)動中連續(xù)地完成整個(gè)分配、傳遞、分離過程；無固相載體，避免了待分離樣品與固相載體表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而變成不可逆吸附；分辨率高，可分離純品；可采用正向或反向的連續(xù)洗脫、步級洗脫、梯度洗脫等方式；可采用多種多樣的溶劑系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的對流分配；能在一個(gè)流程中分離復(fù)雜樣品中極性差異極大的各個(gè)組分，特別是能有效地分離強(qiáng)極性的組分；儀器及試劑成本明顯低于高效液相色譜，適用于制備高純度、高附加值的化合物。12整理課件ppt超臨界流體色譜法(SFC)

以超臨界流體作流動相，它通過控制壓力調(diào)節(jié)流動相的密度實(shí)現(xiàn)對溶解度的調(diào)節(jié)，從而使不同物質(zhì)分別進(jìn)行溶解與分離。超臨界流體溶解能力強(qiáng)，流動性好，傳質(zhì)速率快，融合了HPLC和GC的優(yōu)點(diǎn)而部分地避免了它們的缺點(diǎn)。SFC比GC應(yīng)用范圍更廣，比HPLC定量效果更好，分離的時(shí)間更短，樣品的前處理更簡單，更易與大型分析儀如質(zhì)譜儀、傅里葉變換紅外光譜儀和核磁共振譜儀等聯(lián)用。SFC適用范圍很廣，理論上，能夠用HPLC分離和測定的化合物，都可以用SFC來分離和測定，某些用HPLC不能分離的物質(zhì)用SFC也能得到較好的效果。

13整理課件ppt近10多年來發(fā)展很快的高效毛細(xì)管電泳技術(shù)(HPCE)是一種高效分離分析技術(shù)，以高壓電場為驅(qū)動，毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。具有靈敏度高、柱效高、分析速度快、所需樣品量少、溶劑消耗少和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。不僅適用于小分子酸、堿、鹽及中性分子和生物大分子如核酸、多肽、蛋白質(zhì)等的分析，在中藥有效成分分析方面也顯示出一定優(yōu)勢。14整理課件ppt中藥紫外光譜(UV)特征的差異，在—定程度上反映了中藥化學(xué)成分的差異。某些情況下，偽品雖可在外觀上以假亂真，但其化學(xué)成分的組成和含量與正品必有差異，這種差異在紫外光譜上必有所反映。如果中藥親緣相近而紫外光譜不易區(qū)別，可采用多階導(dǎo)數(shù)光譜法提高分辨率。15整理課件ppt紅外光譜(IR)一直是藥品鑒定的權(quán)威方法，但這是對純物質(zhì)而言的。中藥提取液是復(fù)雜的混合物體系，這一混合物的紅外光譜在本質(zhì)上與純化合物的紅外光譜不同，它是混合物中各組分紅外光譜的疊加。中藥各種化學(xué)成分只要質(zhì)和量相對穩(wěn)定，并且樣品的處理方法按統(tǒng)一要求進(jìn)行，則其紅外光譜應(yīng)是相對穩(wěn)定的。這樣得到的混合物紅外光譜應(yīng)該具有一定的客觀性和可重復(fù)性。據(jù)此原理，不必將混合物紅外光譜各主要吸收峰進(jìn)行歸屬，只要在4000~400cm-1范圍內(nèi)比較光譜的差異即可。應(yīng)該指出，紫外和紅外光譜都具有加和性，對于混合物來說，其鑒別專屬性差，分辨率低。需借助計(jì)算機(jī)模式識別技術(shù)或模糊數(shù)學(xué)方法進(jìn)行處理。16整理課件ppt三維熒光光譜指紋技術(shù)是研究樣本的三維熒光指紋特征，建立起對照品的三維熒光指紋圖譜，而不同的藥物具有各自特征的指紋圖類型和特征指紋，藥物的熒光強(qiáng)度與其含量成正相關(guān)關(guān)系。因此，熒光強(qiáng)度可作為藥物含量評估的依據(jù)之一。三維熒光光譜技術(shù)比常規(guī)熒光分析方法更能反映激發(fā)波長和發(fā)射波長同時(shí)變化時(shí)的熒光強(qiáng)度信息，而且具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。

17整理課件ppt核磁共振波譜(NMR)是鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法和重要手段。植物中藥特征性化學(xué)成分往往不限一種，多表現(xiàn)為特征性成分組。因此，其特征性標(biāo)準(zhǔn)提取物的NMR譜是其中各種成分圖譜的疊加。在混合物的NMR圖譜上，除每個(gè)信號在磁場中的共振數(shù)據(jù)外，信號的相對強(qiáng)弱反映了混合物中各組分的相對含量。當(dāng)圖譜不太復(fù)雜時(shí)，也可觀察到某些信號的偶合關(guān)系。通過對各化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和NMR研究，可實(shí)現(xiàn)植物中藥NMR指紋圖譜的解析。

18整理課件ppt傳統(tǒng)的質(zhì)譜技術(shù)無法測定大分子(分子量超過2000Da)、極性分子和難汽化分子的結(jié)構(gòu)。電噴霧電離(electrosprayionization，ESI)和基質(zhì)輔助的激光解吸電離(matrixassistedlaserdesorptionionization，MALDI)等軟電離技術(shù)使簡便、快速、準(zhǔn)確地研究生物大分子成為可能。目前質(zhì)譜法已成為研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)和核酸的核心技術(shù)之一。將中藥提取物置于質(zhì)譜儀中進(jìn)行電子轟擊電離，可獲得提取物中化學(xué)成分的EI-MS圖。不同中藥提取物所含成分不同，所得質(zhì)譜圖顯示的分子離子峰及進(jìn)一步的裂解碎片峰亦不一致，可用于鑒別。MS法靈敏度及準(zhǔn)確度高，指紋特征性強(qiáng)，常與HPLC、GC聯(lián)用。液相色譜可以起到脫鹽和濃縮樣品的作用，減少鹽或其它小分子對樣品離子化的影響而降低樣品的損耗和污染。液相色譜與質(zhì)譜在線聯(lián)用使質(zhì)譜法與常規(guī)的蛋白質(zhì)分析方法可以很好的聯(lián)用，其精確度和靈敏度都大大超過了常規(guī)方法。并且，快速流動的在線分離技術(shù)是一種高效率的生物分析方法。用LC/ESI/MS進(jìn)行生物大分子的分析鑒定能獲得滿意的結(jié)果。

19整理課件pptX射線衍射法(XRD)是研究物質(zhì)的物相和晶體結(jié)構(gòu)的主要方法。當(dāng)對某一物質(zhì)進(jìn)行衍射分析時(shí)，該物質(zhì)被射線照射而產(chǎn)生不同程度的衍射現(xiàn)象。物質(zhì)的組成、晶型、分子內(nèi)成鍵方式、分子的構(gòu)型等決定該物質(zhì)產(chǎn)生特有的衍射圖譜。如果是混合物，則所得衍射圖是各組成成分衍射效應(yīng)的疊加。只要混合物的組成是恒定的，衍射圖就可作為混合物的特征譜。衍射法所獲得的信息量大，指紋性強(qiáng)，穩(wěn)定可靠，是中藥定性鑒別的可靠依據(jù)。另外，該方法所需樣品量小，不破壞樣品，操作簡單。

20整理課件ppt現(xiàn)代分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸序列含有生命有機(jī)物構(gòu)建、維持和繁殖生命所必需的遺傳信息，不同種生物體含有不同的DNA序列，同種生物體既有相同的DNA序列，保持同種生物體的遺傳性狀，又具有多態(tài)性，使同種生物各個(gè)體千差萬別。由于這種核苷酸序列是相對穩(wěn)定的，因而可以利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建DNA指紋圖。其原理是：每個(gè)生物體個(gè)體的DNA經(jīng)酶切后，電泳分離，用標(biāo)記的DNA探針雜交和放射自顯影后形成的帶紋分布應(yīng)該是有區(qū)別的，具有個(gè)體、群體和物種的特異性(DNAfingerprintion，DNAfp)。如要了解中藥復(fù)方制劑中的某味藥是否存在，通過對這種中藥材的分子遺傳標(biāo)記的研究，找到具有該種高度特異性的片段，便可以此為基礎(chǔ)，制備出對該種高度特異性的寡核苷酸探針，再經(jīng)分子雜交進(jìn)行指紋分析，即可達(dá)到鑒別目的。DNA指紋圖具有高度的個(gè)體特異性。DNA指紋圖譜技術(shù)包括AP-PCR(arbitraryprimerPCR，任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，randomlyamplifiedpolymorphicDNA)兩種指紋圖譜技術(shù)。RFLP(限制性[內(nèi)切酶]片段長度多態(tài)性，restrictionfragmentlengthpolymorphism)是最常用的構(gòu)建DNA指紋圖的方法，但該法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使應(yīng)用受到限制。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)標(biāo)記，可以在特異DNA序列尚不清楚的情況下，檢測DNA的多態(tài)性，這是構(gòu)建中藥指紋圖譜的新方法，具有極好的應(yīng)用前景。此外，還有SSR(簡單重復(fù)序列，simplesequencerepeat)、ISSR(簡單重復(fù)序列間區(qū)，intersimplesequencerepeat)、AFLP(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，amplifiedfragmentlengthpolymorphism)及小衛(wèi)星等。

21整理課件ppt多維多息特征譜即聯(lián)用技術(shù)——