《重組蛋白表達體系》課件

《重組蛋白表達體系》PPT課件目錄重組蛋白表達體系概述重組蛋白表達體系的構(gòu)建重組蛋白的表達重組蛋白的分離與純化重組蛋白的表達影響因素重組蛋白表達體系的優(yōu)化01重組蛋白表達體系概述Part重組蛋白表達體系的建立需要經(jīng)過基因克隆、載體構(gòu)建、宿主細胞轉(zhuǎn)化、目的蛋白質(zhì)表達及純化等步驟。重組蛋白表達體系具有高效、可調(diào)控、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域中的重要技術(shù)手段。重組蛋白表達體系是指通過基因工程技術(shù)，將外源基因在宿主細胞中進行表達，從而獲得目的蛋白質(zhì)的過程。重組蛋白表達體系的基本概念以大腸桿菌為代表的原核生物作為宿主細胞，具有操作簡便、成本低廉等優(yōu)點，適用于表達結(jié)構(gòu)簡單、易于純化的蛋白質(zhì)。原核表達體系以酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等為代表的真核生物作為宿主細胞，適用于表達復(fù)雜結(jié)構(gòu)、功能多樣的蛋白質(zhì)，但操作復(fù)雜、成本較高。真核表達體系通過基因工程技術(shù)手段，在宿主細胞中引入特定的轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，使目的蛋白質(zhì)具有與天然蛋白質(zhì)相同的修飾，如磷酸化、糖基化等。轉(zhuǎn)錄后修飾體系重組蛋白表達體系的種類重組蛋白表達體系的應(yīng)用生物醫(yī)藥領(lǐng)域用于生產(chǎn)藥物、疫苗、診斷試劑等，提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本。農(nóng)業(yè)領(lǐng)域用于改良農(nóng)作物性狀、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因食品等，提高產(chǎn)量、抗病抗蟲等。工業(yè)領(lǐng)域用于生產(chǎn)酶、蛋白質(zhì)等生物催化劑和工業(yè)原料，提高生產(chǎn)效率、降低環(huán)境污染。02重組蛋白表達體系的構(gòu)建Part通過分子生物學技術(shù)，從生物體中分離出目的基因的DNA片段?；蚩寺∪绻康幕驘o法從生物體中直接獲得，可以通過人工合成的方法獲得?；蚝铣赡康幕虻墨@取質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，可以自我復(fù)制并穩(wěn)定地存在于宿主細胞中。病毒載體可以將目的基因插入到病毒基因組中，并利用病毒的復(fù)制機制在宿主細胞中表達目的基因。載體的選擇與構(gòu)建病毒載體質(zhì)粒載體限制性酶切使用限制性酶對目的基因和載體進行酶切，產(chǎn)生黏性末端或平末端。連接反應(yīng)將酶切后的目的基因和載體進行連接，形成重組分子。目的基因與載體的連接重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與篩選轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到宿主細胞中，常用的方法有電穿孔法和化學轉(zhuǎn)化法。篩選通過特定的篩選標記對轉(zhuǎn)化子進行篩選，如抗生素抗性標記、報告基因等。03重組蛋白的表達Part宿主細胞選擇根據(jù)重組蛋白的特性選擇合適的宿主細胞，如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等。宿主細胞培養(yǎng)培養(yǎng)宿主細胞，使其達到適合重組蛋白表達的狀態(tài)，包括調(diào)整培養(yǎng)基成分、控制培養(yǎng)溫度和pH等。宿主細胞的選擇與培養(yǎng)VS根據(jù)選用的宿主細胞和重組蛋白特性，選擇適當?shù)恼T導(dǎo)方法，如添加誘導(dǎo)劑、改變溫度或pH等。表達水平通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提高重組蛋白的表達水平，確保獲得足量的目標蛋白。誘導(dǎo)方法重組蛋白的表達誘導(dǎo)采用適當?shù)臋z測方法，如Westernblot、ELISA等，對重組蛋白的表達進行定性或定量分析。對表達產(chǎn)物進行純化，去除雜質(zhì)，獲得高純度的目標蛋白，以便后續(xù)研究或應(yīng)用。檢測方法表達產(chǎn)物純化重組蛋白的表達檢測04重組蛋白的分離與純化Part通過物理或化學方法破碎細胞，釋放細胞內(nèi)表達的重組蛋白。細胞破碎利用離心機將破碎的細胞碎片與上清液中的重組蛋白進行分離。離心分離細胞破碎與離心分離蛋白質(zhì)的沉淀與萃取通過改變?nèi)芤旱膒H、離子強度或添加有機溶劑等手段，使重組蛋白從溶液中沉淀下來。沉淀利用不同物質(zhì)在兩種不相溶溶劑中的溶解度差異，將重組蛋白從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中。萃取凝膠過濾層析利用不同大小的蛋白質(zhì)在凝膠上的擴散速度不同進行分離。要點一要點二離子交換層析利用蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)差異進行分離，常用于去除雜質(zhì)和純化目的蛋白。蛋白質(zhì)的層析分離聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和電荷性質(zhì)進行分離。等電聚焦電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點進行分離，常用于確定蛋白質(zhì)的等電點并進一步純化。蛋白質(zhì)的電泳純化05重組蛋白的表達影響因素Part03宿主細胞的生長條件宿主細胞的生長條件如溫度、pH、培養(yǎng)基成分等對重組蛋白的表達也有影響。01宿主細胞的遺傳背景不同的宿主細胞具有不同的基因組背景，對重組蛋白的表達有顯著影響。02宿主細胞的代謝狀態(tài)宿主細胞的代謝狀態(tài)影響其能量和物質(zhì)供給，從而影響重組蛋白的表達。宿主細胞的影響123某些蛋白酶可能對重組蛋白產(chǎn)生降解作用，影響其穩(wěn)定性。蛋白酶的穩(wěn)定性重組蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性對其表達和功能有重要影響。蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性重組蛋白與其他細胞成分的相互作用可能影響其穩(wěn)定性。蛋白與其他分子的相互作用重組蛋白的穩(wěn)定性表達載體和宿主細胞選擇選擇合適的表達載體和宿主細胞可以提高重組蛋白的表達量。誘導(dǎo)條件的選擇選擇適當?shù)恼T導(dǎo)條件如誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機等可以影響重組蛋白的表達量?；蛟O(shè)計和優(yōu)化基因序列的優(yōu)化和改造可以顯著提高重組蛋白的表達量。重組蛋白的表達量06重組蛋白表達體系的優(yōu)化Part基因敲除通過基因敲除技術(shù)，去除宿主細胞中與重組蛋白表達相關(guān)的內(nèi)源性基因，減少內(nèi)源性蛋白的干擾。基因突變通過基因突變技術(shù)，對宿主細胞中與重組蛋白表達相關(guān)的基因進行突變，以提高重組蛋白的表達水平。基因擴增通過基因擴增技術(shù)，增加宿主細胞中與重組蛋白表達相關(guān)的基因拷貝數(shù)，提高重組蛋白的表達量。宿主細胞的遺傳改造培養(yǎng)基成分01優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，如添加適量的氨基酸、維生素和微量元素等，以促進重組蛋白的表達。溫度和pH值02調(diào)整培養(yǎng)溫度和pH值，以適應(yīng)重組蛋白的表達需求，提高表達效率。誘導(dǎo)劑濃度和添加時間03優(yōu)化誘導(dǎo)劑的濃度和添加時間，以最大化重組蛋白的表達量。表達誘導(dǎo)條件的優(yōu)化STEP01STEP02STEP03蛋白質(zhì)純化方法的改進親和標簽采用多步純化方法