第六章微生物的生長繁殖及其控制

第五章微生物的營養(yǎng)二、微生物的營養(yǎng)要素六要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機(jī)鹽和水營養(yǎng)物質(zhì)按照它們?cè)跈C(jī)體中的生理作用不同，可以將它們區(qū)分成六大類。功能:參與微生物細(xì)胞的組成提供微生物機(jī)體進(jìn)行各種生理活動(dòng)所需的能量形成微生物代謝產(chǎn)物的來源

一、碳源(carbonsource)提供微生物營養(yǎng)所需碳元素的營養(yǎng)源。有機(jī)碳源：蛋白質(zhì)，核酸，淀粉，葡萄糖等無機(jī)碳源：CO2,Na2CO3,CaCO3等

異養(yǎng)微生物：必須利用有機(jī)碳源自養(yǎng)微生物：能利用無機(jī)碳源對(duì)于為數(shù)眾多的化能異養(yǎng)微生物來說，碳源是兼有能源功能營養(yǎng)物。微生物可利用的碳源糖類：葡萄糖，果糖，麥芽糖，蔗糖，淀粉，半乳糖，乳糖，甘露糖，纖維二糖，纖維素，半纖維素，甲殼素，木質(zhì)素，等有機(jī)酸：乳酸，檸檬酸，延胡索酸，低級(jí)脂肪酸，高級(jí)脂肪酸，氨基酸，等醇類：乙醇，等脂類：脂肪，磷脂，等烴類：天然氣，石油，石油餾分，石蠟油，等CO2碳酸鹽：NaHCO3,CaCO3,白堊，等其他：芳香族化合物，氰化物，蛋白質(zhì)，肽，核酸目前在微生物發(fā)酵工業(yè)中，常根據(jù)不同微生物的需要，利用各種農(nóng)副產(chǎn)品如玉米粉、米糠、麥麩、馬鈴薯、甘薯以及各種野生植物的淀粉，作為微生物生產(chǎn)廉價(jià)的碳源。這類碳源往往包含了幾種營養(yǎng)要素。

二、氮源(nitrogensource)凡能提供微生物營養(yǎng)所需氮元素的營養(yǎng)源。氮源一般不作能源。有機(jī)氮源：蛋白胨、黃豆粉、玉米漿無機(jī)氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4、N2微生物細(xì)胞中大約含氮5％～13％，它是微生物細(xì)胞蛋白蛋和核酸的主要成分。銨鹽和氨基酸被微生物吸收后能直接被利用NO3－和蛋白質(zhì)吸收后還需復(fù)原降解才可利用速效氮源遲效氮源

實(shí)驗(yàn)室常用的氮源有硝酸銨、硫酸銨、尿素、碳酸銨、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、黃豆粉、玉米漿等。三、能源(energysource)能為微生物的生命活動(dòng)提供最初能量來源的化學(xué)物質(zhì)或輻射能。異養(yǎng)微生物的碳源同時(shí)也是能源無機(jī)物：化能自養(yǎng)微生物的能源能源譜化學(xué)物質(zhì)輻射能：光能自養(yǎng)和光能異養(yǎng)微生物的能源有機(jī)物：化能異養(yǎng)微生物的能源四、生長因子(growthfactor)

一類對(duì)微生物正常代謝必不可少且又不能從簡單的碳源，氮源自行合成的、所需極微量的有機(jī)物。生長因子主要是維生素、氨基酸和嘌呤、嘧啶等特殊有機(jī)營養(yǎng)物。主要功能是提供微生物細(xì)胞重要的化學(xué)物質(zhì)，作為酶的輔基或輔酶參與代謝。在自然界中自養(yǎng)型細(xì)菌和大多數(shù)腐生細(xì)菌、霉菌都能自己合成許多生長輔助物質(zhì)，不需要另外供給就能正常生長發(fā)育。

不能合成因子的，添加方式是在培養(yǎng)基中加酵母膏、豆芽汁、玉米漿、肝臟浸出液或組織提取液等。五、無機(jī)鹽(inorganicsalts)所需濃度在10-3--10-4M的元素為大量元素

所需濃度在10-6--10-8M的元素為微量元素微生物生長需要多種礦質(zhì)元素，如磷、硫、鎂、鉀、鈣、鈉、鐵、硼、錳、銅、鋅、鉬等。無機(jī)鹽的生理功能無機(jī)鹽大量元素微量元素一般功能特殊功能細(xì)胞內(nèi)一般分子成分(P、S、Ca、Mg、Fe等)生理調(diào)節(jié)物質(zhì)滲透壓的維持(Na+等)酶的激活劑(Mg等)pH的穩(wěn)定化能自養(yǎng)菌的能源(S、Fe2+、NH4+、MO2-等)無氧呼吸時(shí)的氫受體(NO3-、SO42-等)酶的激活劑(Cu2+、Mn2+、Zn2+等)特殊分子結(jié)構(gòu)成分(Co、Mo等)六、水存在狀態(tài)：游離態(tài)〔溶劑〕和結(jié)合態(tài)〔結(jié)構(gòu)組成〕生理作用：細(xì)胞組成成分生化反響溶劑化學(xué)、生理反響介質(zhì)物質(zhì)運(yùn)輸媒體調(diào)節(jié)細(xì)胞溫度維持細(xì)胞的滲透壓微生物的營養(yǎng)類型

營養(yǎng)類型能源碳源實(shí)例光能自養(yǎng)型光能CO2藍(lán)細(xì)菌紫硫細(xì)菌綠硫細(xì)菌藻類光能異養(yǎng)型光能CO2及簡單有機(jī)物紅螺細(xì)菌化能自養(yǎng)型無機(jī)物CO2硝化細(xì)菌硫化細(xì)菌鐵細(xì)菌氫細(xì)菌化能異養(yǎng)型有機(jī)物有機(jī)物絕大多數(shù)微生物，原生動(dòng)物1．光能自養(yǎng)型能以CO2為主要唯一或主要碳源進(jìn)行光合作用獲取生長所需要的能量以無機(jī)物如H2、H2S、S等作為供氫體或電子供體，使CO2復(fù)原為細(xì)胞物質(zhì)例如，藻類及藍(lán)細(xì)菌等和植物一樣，以水為電子供體〔供氫體〕，進(jìn)行產(chǎn)氧型的光合作用，合成細(xì)胞物質(zhì)。而紅硫細(xì)菌，以H2S為電子供體，產(chǎn)生細(xì)胞物質(zhì)，并伴隨硫元素的產(chǎn)生。2．光能異養(yǎng)型不能以CO2為主要或唯一的碳源以有機(jī)物作為供氫體，利用光能將CO2復(fù)原為細(xì)胞物質(zhì)在生長時(shí)大多數(shù)需要外源的生長因子例如，紅螺菌屬中的一些細(xì)菌能利用異丙醇作為供氫體，將CO2復(fù)原成細(xì)胞物質(zhì)，同時(shí)積累丙酮。3．化能自養(yǎng)型生長所需要的能量來自無機(jī)物氧化過程中放出的化學(xué)能以CO2或碳酸鹽作為唯一或主要碳源進(jìn)行生長時(shí)，利用H2、H2S、Fe2+、NH3或NO2-等作為電子供體使CO2復(fù)原成細(xì)胞物質(zhì)?；軣o機(jī)自養(yǎng)型只存在于微生物中，可在完全無機(jī)及無光的環(huán)境中生長。它們廣泛分布于土壤及水環(huán)境中,參與地球物質(zhì)循環(huán)4．化能異養(yǎng)型生長所需要的能量均來自有機(jī)物氧化過程中放出的化學(xué)能生長所需要的碳源主要是一些有機(jī)化合物，如淀粉、糖類、纖維素、有機(jī)酸等。大多數(shù)細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物都是化能有機(jī)異養(yǎng)型微生所有致病微生物均為化能有機(jī)異養(yǎng)型微生物不同營養(yǎng)類型之間的界限并非絕對(duì)異養(yǎng)型微生物并非絕對(duì)不能利用CO2；自養(yǎng)型微生物也并非不能利用有機(jī)物進(jìn)行生長；有些微生物在不同生長條件下生長時(shí),其營養(yǎng)類型也會(huì)發(fā)生改變；例如紫色非硫細(xì)菌(purplenonsulphurbacteria)：沒有有機(jī)物時(shí)：同化CO2，為自養(yǎng)型微生物；有機(jī)物存在時(shí)：利用有機(jī)物進(jìn)行生長，為異養(yǎng)型微生物；光照和厭氧條件下：利用光能生長，為光能營養(yǎng)型微生物；黑暗與好氧條件下：依靠有機(jī)物氧化產(chǎn)生的化學(xué)能生長，為化能營養(yǎng)型微生

原生質(zhì)膜是一種半透性膜，營養(yǎng)物質(zhì)通過原生質(zhì)膜上的小孔，由高濃度的胞外環(huán)境向低濃度的胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散。一、單純擴(kuò)散(simplediffusion)依靠胞內(nèi)外溶液濃度差，順濃度梯度運(yùn)輸；不消耗代謝能，無特異性；運(yùn)輸氧、二氧化碳、甘油、乙醇、某些氨基酸等小分子；運(yùn)輸速率與膜內(nèi)外物質(zhì)的濃度差成正比特點(diǎn)物質(zhì)跨膜擴(kuò)散的能力和速率與該物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān),分子量小、脂溶性、極性小的物質(zhì)易通過擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞。水是唯一可以通過擴(kuò)散自由通過原生質(zhì)膜的分子，脂肪酸、乙醇、甘油、一些氣體〔O2、CO2〕及某些氨基酸在一定程度上也可通過自由擴(kuò)散進(jìn)出細(xì)胞。擴(kuò)散并不是微生物細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要方式.二、促進(jìn)擴(kuò)散(facilitateddiffusion)利用膜內(nèi)、膜外被運(yùn)輸物質(zhì)和載體蛋白的親和力的不同。被動(dòng)的物質(zhì)跨膜運(yùn)輸方式.載體只影響物質(zhì)的運(yùn)輸速率，并不改變?cè)撐镔|(zhì)在膜內(nèi)外形成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；特點(diǎn)：參與運(yùn)輸?shù)奈镔|(zhì)本身的分子結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化需要特異性的載體蛋白順濃度梯度運(yùn)輸不消耗能量運(yùn)輸硫酸根、磷酸根、糖〔真核〕載體蛋白(carrierprotein):載體蛋白需要同被運(yùn)輸?shù)碾x子和分子結(jié)合,然后通過自身的構(gòu)型變化或移動(dòng)完成物質(zhì)運(yùn)輸?shù)哪さ鞍住＜赐感悦?、移位酶〔大多通過誘導(dǎo)產(chǎn)生〕有物特異性每種載體蛋白運(yùn)輸相應(yīng)的物質(zhì)可加快運(yùn)輸速度，但不能逆濃度運(yùn)輸

通過促進(jìn)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)主要有氨基酸、單糖、維生素及無機(jī)鹽等。一般微生物通過專一的載體蛋白運(yùn)輸相應(yīng)的物質(zhì)，但也有微生物對(duì)同一物質(zhì)的運(yùn)輸由一種以上的載體蛋白來完成。促進(jìn)擴(kuò)散常見于真核微生物。3、主動(dòng)運(yùn)輸(activetransport)特點(diǎn)：是微生物吸收營養(yǎng)的主要方式可逆濃度梯度運(yùn)輸，耗能需載體蛋白，有特異性運(yùn)輸有機(jī)離子、無機(jī)離子、氨基酸、乳糖等糖類需要特異性載體蛋白需要能量來改變載體蛋白的構(gòu)象

4、基團(tuán)轉(zhuǎn)位(grouptranslocation)特點(diǎn)：屬主動(dòng)運(yùn)輸類型〔有一個(gè)復(fù)雜的運(yùn)輸系統(tǒng)來完成物質(zhì)的運(yùn)輸，而物質(zhì)在運(yùn)輸過程中發(fā)生化學(xué)變化〕溶質(zhì)分子發(fā)生化學(xué)修飾運(yùn)輸葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等每輸入一個(gè)葡萄糖分子，就要消耗一個(gè)ATP的能量。

基團(tuán)轉(zhuǎn)移主要存在于厭氧型和兼性厭氧型細(xì)胞中，主要用于糖的運(yùn)輸，脂肪酸、核苷、堿基等也可以通過這種方式運(yùn)輸。四種運(yùn)送營養(yǎng)方式的比較比較工程單純擴(kuò)散 促進(jìn)擴(kuò)散主動(dòng)運(yùn)輸基團(tuán)移位特異載體蛋白無 有 有 有 運(yùn)送速度 慢 快 快 快 溶質(zhì)運(yùn)送方向由濃至稀由濃至稀 由稀至濃 由稀至濃平衡時(shí)內(nèi)外濃度內(nèi)外相等 內(nèi)外相等 內(nèi)部高 內(nèi)部高 運(yùn)送分子 無特異性 特異性 特異性 特異性 能量消耗 不需要 不需要 需要 需要 運(yùn)送前后溶質(zhì)分子不變 不變 不變 改變 載體飽和效應(yīng) 無 有 有 有 運(yùn)送對(duì)象舉例水、O2糖、SO42-氨基酸、乳糖葡萄糖\嘌呤第四節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)基是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。任何培養(yǎng)基都應(yīng)該具備微生物生長所需要六大營養(yǎng)要素碳源、氮源、無機(jī)鹽、能源、生長因子、水二、選擇和配制培養(yǎng)基的原那么和方法〔一〕四個(gè)原那么1、目的明確〔根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基〕培養(yǎng)什么微生物、獲得什么產(chǎn)物、用途2、營養(yǎng)協(xié)調(diào)

營養(yǎng)協(xié)調(diào)(注意營養(yǎng)物的濃度和配比，特別是碳氮比C/N比)C/N比:微生物培養(yǎng)基中所含的碳源中的碳原子與氮源中氮原子的摩爾數(shù)之比。不是簡單的某碳源的重量與氮源的重量之比。因?yàn)?，不同種類的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量差異很大。3、物理化學(xué)條件適宜pH滲透壓和水活度氧化復(fù)原電位滲透壓:高濃度溶液向低濃度溶液滲透時(shí)，其溶質(zhì)分子所產(chǎn)生的壓力。高滲溶液會(huì)導(dǎo)致微生物細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁別離低滲溶液會(huì)導(dǎo)致微生物細(xì)胞吸水膨脹甚至破裂用水活度(wateractivity,aw)表示aw：在天然環(huán)境中，微生物可實(shí)際利用的自由水或游離水含量。aw

=P/PoP:溶液的蒸汽壓

Po:純水的蒸汽壓在常溫常壓下，純水的aw為1.00微生物一般在αw為0.60～0.99的條件下生長氧化復(fù)原電位Eh：氧化復(fù)原系統(tǒng)中的復(fù)原劑釋放電子或氧化劑接受電子的趨勢。好氧微生物：＞+0.1V一般+0.3~+0.4V厭氧微生物：+0.1V以下兼性微生物：+0.1V以上好氧呼吸+0.1V以下進(jìn)行發(fā)酵pH：微生物有最正確生長pH

細(xì)菌:pH7.0~8.0放線菌：pH7.0~8.5

酵母菌:pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~6.0微生物在生長過程中培養(yǎng)基pH值可能發(fā)生的變化：在含糖基質(zhì)上生長,會(huì)產(chǎn)酸而使pH下降，在分解蛋白質(zhì)和氨基酸時(shí),會(huì)產(chǎn)NH3而使pH上升，以(NH4)2SO4作N源,會(huì)過剩SO42-,而使pH下降，分解利用陽離子化合物如：NaNO3,會(huì)過剩Na+而使pH上升。4、原料來源的選擇以粗代精以野代家以廢代好以國代進(jìn)以簡代繁以氮代朊以烴代糧以纖代糖滅菌處理高壓蒸汽滅菌：121℃，15～20min高溫滅菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的破壞及pH變化設(shè)計(jì)方法生態(tài)模擬模擬自然生長條件，利用自然基質(zhì)參閱文獻(xiàn)

精心設(shè)計(jì)試驗(yàn)比較由定性到定量、由小到大、由實(shí)驗(yàn)室到工廠規(guī)模逐步擴(kuò)大。培養(yǎng)基類型根據(jù)培養(yǎng)基成分：天然培養(yǎng)基指一些利用動(dòng)、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，成分未知。如培養(yǎng)細(xì)菌所用的肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基等。

優(yōu)點(diǎn)：取材方便、營養(yǎng)豐富、種類多樣、配制方便組合培養(yǎng)基是一類用多種高純化學(xué)試劑配制的、各成分〔包含微量元素〕的量都確切知道的培養(yǎng)基。如培養(yǎng)細(xì)菌所用的葡萄糖銨鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌的淀粉硝酸鹽培養(yǎng)基〔高氏一號(hào)〕。較昂貴，一般用于研究工作〔代謝、遺傳分析〕優(yōu)點(diǎn)：組份精確、重復(fù)性好半組合培養(yǎng)基按目的不同劃分種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基繁殖培養(yǎng)基保藏培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富。尤其是氮源含量高，即碳氮比值低發(fā)酵培養(yǎng)基，它的氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低；假設(shè)發(fā)酵產(chǎn)物為含氮化合物時(shí)，有時(shí)還提高培養(yǎng)基中氮源含量按培養(yǎng)基外觀的物理狀態(tài)：固體、半固體、液體、脫水。固體培養(yǎng)：一般加有凝固劑，凝固劑含量一般為1.5～2％凝固劑的條件：不被微生物分解利用，生長溫度范圍內(nèi)保持固體狀態(tài)，凝固點(diǎn)溫度對(duì)微生物無害，不因滅菌而破壞，透明度好、配制方便、價(jià)格低。常用的為瓊脂與明膠?？捎糜冢壕N別離、鑒定、保藏等。半固體培養(yǎng)基，凝固劑含量一般約為0.5%,用途：觀察細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)液體培養(yǎng)基:培養(yǎng)基中沒有凝固劑。用途：大量培養(yǎng)微生物，研究生理代謝等。脫水培養(yǎng)基:商品培養(yǎng)基依功能不同：選擇培養(yǎng)基(Selectedmedium)：根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求或其對(duì)某化學(xué)、物理因素的抗性而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基。功能：混合菌中劣勢菌變成優(yōu)勢菌，從而提高該菌的篩選效率鑒別培養(yǎng)基(Differentialmedium)：參加能與某一菌的無色代謝產(chǎn)物發(fā)生反響的指示劑，從而用肉眼就能使該菌落與外形相似的其他菌落相區(qū)分的培養(yǎng)基。用途：細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)遺傳研究，第六章

微生物的生長及其控制

單位時(shí)間里微生物數(shù)量或生物量〔Biomass〕的變化微生物生長：微生物生長測量方法個(gè)體計(jì)數(shù)法重量法生理指標(biāo)法1總細(xì)胞計(jì)數(shù)法1〕血球計(jì)數(shù)板法缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的菌濃度；只適用于酵母菌和霉菌的孢子一、個(gè)體計(jì)數(shù)法〔一〕直接法2〕涂片計(jì)數(shù)法將體積的待測樣品均勻的涂在載玻片的面積上，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下選擇假設(shè)干視野計(jì)算細(xì)胞的數(shù)量。視野的面積可用鏡臺(tái)測微尺測得直徑并計(jì)算出來。〔二〕間接計(jì)數(shù)法1.活菌計(jì)數(shù)法1〕涂布平板法2〕澆注平板法采用培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確，否那么難以得到正確的結(jié)果：樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個(gè)稀釋度的菌液；同一稀釋度三個(gè)重復(fù),取平均值；每個(gè)平板上的菌落數(shù)目適宜，便于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；一個(gè)菌落可能是多個(gè)細(xì)胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成單位〔colonyformingunits，CFU〕來表示，而不是直接表示為細(xì)胞數(shù)。當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器，然后將將膜轉(zhuǎn)到相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。膜過濾培養(yǎng)法2、比濁法二、重量法

收集微生物菌體，或?qū)⑽⑸锱囵B(yǎng)液離心，收集細(xì)胞沉淀物，然后稱重。1.濕重法收集微生物菌體，或?qū)⑽⑸锱囵B(yǎng)液離心，收集細(xì)胞沉淀物，然后稱重。2.干重法將微生物菌體或離心得到的細(xì)胞沉淀物置100—105℃的烘箱中枯燥至水份去除，然后再稱重。3.通過樣品中蛋白質(zhì)、核酸含量的測定間接推算微生物群體的生物量；3.生理指標(biāo)測定法樣品中微生物數(shù)量多或生長旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計(jì)等設(shè)備來測定相應(yīng)的指標(biāo)。常用于對(duì)微生物的快速鑒定與檢測微生物的生理指標(biāo)，如呼吸強(qiáng)度，耗氧量、酶活性、生物熱等與其群體的規(guī)模成正相關(guān)。三、細(xì)菌群體生長規(guī)律在不補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)或移去培養(yǎng)物，保持整個(gè)培養(yǎng)液體積不變條件下，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)，根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)細(xì)菌數(shù)量的變化，可以作出一條反映細(xì)菌在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線。生長曲線第二節(jié)微生物的生長1〕延滯期將少量菌種接入新鮮培養(yǎng)基后，在開始一段時(shí)間內(nèi)菌數(shù)不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零。也稱延遲期、適應(yīng)期。延滯期特點(diǎn)?生長速常數(shù)為零?細(xì)胞形態(tài)變大或增長細(xì)胞內(nèi)的RNA尤其是rRNA含量增高合成代謝十分活潑對(duì)外界不良因素反響敏感緩慢期出現(xiàn)的原因：微生物接種到一個(gè)新的環(huán)境，暫時(shí)缺乏分解和催化有關(guān)底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產(chǎn)物等。為產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，就需要一段適應(yīng)期。影響延滯期長短的因素接種齡:對(duì)數(shù)期“種子〞，延滯期較短；延滯期或衰亡期“種子〞,延滯期較長；接種量：接種量大，延滯期較短；接種量小，延滯期較長；培養(yǎng)基成分:培養(yǎng)基成分豐富的,延滯期較短；培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基一致,延滯期較短；

縮短延滯期措施：①通過遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性使緩慢期縮短；②利用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞作為“種子〞；③盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；④適當(dāng)擴(kuò)大接種量等方式縮短緩慢期，克服不良的影響。2〕指數(shù)期特點(diǎn)?生長速率常數(shù)R最大?細(xì)胞進(jìn)行平衡生長酶系活潑，代謝旺盛影響指數(shù)期的因素

菌種：不同菌種的代時(shí)差異極大

營養(yǎng)成分：營養(yǎng)越豐富，代時(shí)越短

營養(yǎng)物濃度：影響微生物的生長速率和總生長量

培養(yǎng)溫度：影響微生物的生長速率是代謝、生理研究的良好材料是增殖噬菌體的最適宿主菌齡是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子〞的最正確種齡G+染色鑒定時(shí)采用此期微生物指數(shù)期的實(shí)踐意義3〕穩(wěn)定期特點(diǎn)：1生長速率常數(shù)R等于02菌體產(chǎn)量到達(dá)了最高值3合成次生代謝產(chǎn)物4細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)儲(chǔ)藏物質(zhì)，芽孢菌內(nèi)開始產(chǎn)生芽孢

產(chǎn)生原因：營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不適宜有害代謝廢物的積累〔酸、醇、毒素等〕物化條件〔pH、氧化復(fù)原勢等〕不適宜通過補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)或取走代謝產(chǎn)物或改善培養(yǎng)條件，如對(duì)好氧菌進(jìn)行通氣、攪拌或振蕩等獲得更多的代謝產(chǎn)物4〕衰亡期特點(diǎn)：1R為負(fù)值2細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)不規(guī)那么的衰退形3釋放次生代謝產(chǎn)物，芽孢等4有的菌體開始自溶〔1〕繁殖代數(shù)〔n〕指數(shù)生長方式：1248……2n設(shè)接種時(shí)細(xì)胞數(shù)為B0,時(shí)間為t1,到時(shí)間t2后，繁殖n代，細(xì)胞數(shù)為Bt，它們之間的相互關(guān)系為：Bt=B0*2n以對(duì)數(shù)表示：lgBt=lgB0+nlg2n=lgBt-lgB0=lgBt-lgB0lg20.301世代：由1個(gè)細(xì)胞分裂成為2個(gè)細(xì)胞的間隔被稱為世代。代時(shí)：就是一個(gè)世代所需的時(shí)間，因而也就是群體細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)大1倍所需的時(shí)間，有時(shí)也被稱為倍增時(shí)間。

代時(shí)〔G)=tn五、連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是在微生物的整個(gè)培養(yǎng)期間，通過一定的方式使微生物能以恒定的比生長速率生長并能持續(xù)生長下去的一種培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng)的根本原那么：微生物培養(yǎng)過程中不斷的補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)和以同樣的速率移出培養(yǎng)物連續(xù)培養(yǎng)類型恒濁連續(xù)培養(yǎng)恒化連續(xù)培養(yǎng)(一)恒化連續(xù)培養(yǎng)在整個(gè)培養(yǎng)過程中通過控制培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度根本恒定的方式，保持細(xì)菌的比生長速率恒定，使生長“不斷〞進(jìn)行。生長速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和銨鹽等氮源，或是葡萄糖、麥芽糖等碳源或者是無機(jī)鹽，生長因子等物質(zhì)

恒化器連續(xù)培養(yǎng)通常用于微生物學(xué)的研究，篩選不同的變種。(二)恒濁連續(xù)培養(yǎng)通過連續(xù)培養(yǎng)裝置中的光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細(xì)菌生長連續(xù)進(jìn)行的一種培養(yǎng)方式第三節(jié)

環(huán)境因素對(duì)微生物生長的影響一、溫度根據(jù)微生物生長的最適溫度不同，可以將微生物分為嗜冷、兼性嗜冷、嗜溫、嗜熱和超嗜熱等五種不同的類型。它們都有各自的最低、最適和最高生長溫度范圍。

微生物類型

生長溫度／℃最低最適最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035；嗜溫微生物15-2020-4545以上嗜熱微生物4555-6580超嗜熱或嗜高溫微生物6580-90100以上(二)PH微生物生長過程中機(jī)體內(nèi)發(fā)生的絕大多數(shù)的反響是酶促反響，而酶促反響都有一個(gè)最適pH范圍，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)速率最高，微生物生長速率最大，因此微生物生長也有一個(gè)最適生長的pH范圍。微生物最低PH最適PH最高PH細(xì)菌3-56.5-7.58-10酵母菌2-34.5-5.57-8霉菌1-34.5-5.57-8嗜中性微生物生長的pH范圍是pH5.—8.0，最適生長pH近中性〔pH7.0〕。大多數(shù)細(xì)菌屬于嗜中性微生物。嗜酸性微生物最適生長pH在5.5以下生長的微生物稱之為嗜酸性微生物。嗜堿性微生物生長的pH范圍是pH7.0—11.5，最適生長pH在8.0以上。(三)氧好氧微好氧耐氧型兼性厭氧專性厭氧微生物類型最適生長的O2體積分?jǐn)?shù)好氧微好氧氧的忍耐型兼性厭氧專性厭氧等于或大于20％2％一l0％2％以下有氧或無氧不需要氧、有氧時(shí)死亡一、微生物純培養(yǎng)的別離純化自然環(huán)境如土壤和水中，通常棲息著的是許多不同微生物混雜在一起的群體。哪怕是一粒砂或塵土，也常含有多種細(xì)菌及其它微生物。研究微生物生長通常采用微生物純培養(yǎng)。微生物學(xué)中將在實(shí)驗(yàn)條件下從一個(gè)單細(xì)胞繁殖得到的后代稱為純培養(yǎng)。第四節(jié)微生物微生物培養(yǎng)法概論

平板劃線別離法稀釋倒平板法單孢子或單細(xì)胞別離法利用選擇性培養(yǎng)基別離法1、稀釋倒平板法2、平板劃線法進(jìn)行純化用接種環(huán)以菌操作沾取少許待別離的材料，在無菌平板外表進(jìn)行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續(xù)劃線，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經(jīng)培養(yǎng)后，可在平板外表得到單菌落。3、單孢子或單細(xì)胞別離法采取顯微別離法從混雜群體中直接別離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以獲得純培養(yǎng)。在顯微鏡下使用單孢子別離器進(jìn)行機(jī)械操作，挑取單孢子或單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。也可以采用特制的毛細(xì)管在載玻片的瓊脂涂層上選取單孢子并切割下來，然后移到適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。4、選擇性培養(yǎng)基別離法各種微生物對(duì)不同的化學(xué)試劑、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用這些特性可配制適宜某種微生物而限制其它微生物生長的選擇培養(yǎng)基，用它來培養(yǎng)微生物以獲得純培養(yǎng)。微生物純培養(yǎng)別離方法的比較分離方法應(yīng)用范圍平皿劃線法方法簡便，多用于分離細(xì)菌稀釋倒平皿法即可定性，又可定量，用途廣泛單細(xì)胞挑取法局限于高度專業(yè)化的科學(xué)研究利用選擇培養(yǎng)基法適用于分離某些生理類型較特殊的二、微生物的培養(yǎng)方法根據(jù)氧氣的需要與否分為兩大類：好氧培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)

根據(jù)培養(yǎng)基的物理特性分為兩大類：固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)

〔一〕好氧培養(yǎng)方法瓊脂斜面和瓊脂平皿培養(yǎng)1〕固體好氧培養(yǎng)方法2〕液體好氧培養(yǎng)方法恒溫振蕩培養(yǎng)箱〔二〕厭氧培養(yǎng)方法微生物厭氧培養(yǎng)箱！第四節(jié)微生物生長的控制滅菌〔sterilization〕:采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力的措施消毒(disinfection):采用較溫和的理化因素，僅殺死物體外表或內(nèi)部的病原菌，而對(duì)被消毒對(duì)象根本無害的措施；防腐(antisepsis):利用某種理化因素抑制霉腐微生物生長繁殖，防止食品等發(fā)生霉變的措施?；?chemotherapy)：利用對(duì)病原菌具有高毒力而對(duì)宿主根本無毒的化學(xué)物質(zhì)來抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長繁殖。一、物理控制方法(一)高溫滅菌高壓蒸汽滅菌的溫度越高，微生物死亡越快。通常情況下溫度為121℃。

衡量滅菌效果的指標(biāo)十倍致死時(shí)間：即在一定的溫度條件下，微生物數(shù)量十倍減少所需要的時(shí)間。熱致死時(shí)間：即在一定溫度下殺死所有某一濃度微生物所需要的時(shí)間②干熱滅菌干熱滅菌溫度：150-170℃；時(shí)間：1-2h對(duì)象：金屬器械、玻璃器皿等③煮沸消毒將待消毒物品如注射器、金屬用具、解剖用具等在水中煮沸15min或更長時(shí)間，以殺死細(xì)菌或其他微生物的營養(yǎng)體和少局部的芽孢或孢子。3類濕熱滅菌法————④間隙滅菌法對(duì)于某些培養(yǎng)基，由于高壓蒸汽滅菌會(huì)破壞某些營養(yǎng)成分，可用間隙滅菌法滅菌，即流通蒸汽(或蒸煮)反復(fù)滅菌幾次。例如第一次蒸煮后殺死微生物營養(yǎng)體，冷卻，培養(yǎng)過夜，孢子萌發(fā)，又第二次蒸煮，殺死營養(yǎng)體。這樣反復(fù)2—3次就可以完全殺死營養(yǎng)體和芽孢，也可保持某些營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞。

⑤巴氏消毒法高溫對(duì)牛奶及其熱敏感物質(zhì)不適宜，因?yàn)楦邿崞茐牧耸称返臓I養(yǎng)與風(fēng)味。低溫長時(shí)法：只要在63℃下維持30min高溫短時(shí)法：只要在72℃下維持15s超高溫法瞬時(shí)法:只要在135-150℃下維持2-6s第八章微生物的遺傳與變異

第一節(jié)遺傳的物質(zhì)根底一、三個(gè)證明DNA是遺傳物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)肺炎鏈球菌:S型〔菌體具莢膜，菌落外表光滑，有致病能力〕R型〔菌體無莢膜，菌落外表粗糙，無致病能力〕S型和R型細(xì)胞侵染試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明，將R菌轉(zhuǎn)化為S菌的轉(zhuǎn)化因子是DNA1944年，Avery精確重復(fù)了轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，確定了轉(zhuǎn)化因子實(shí)驗(yàn)證明，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)是DNA。DNA包含有產(chǎn)生完整噬菌體的全部信息。2、噬菌體感染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明，RNA可以傳遞遺傳信息。〔三〕原核生物的質(zhì)粒凡游離于原核生物基因組以外，具有獨(dú)立復(fù)制能力的小型共價(jià)閉合環(huán)狀的dsDNA分子，就是典型的質(zhì)粒。質(zhì)粒所含的基因?qū)λ拗骷?xì)胞一般是非必需的；在某些特殊條件下，質(zhì)粒有時(shí)能賦予宿主細(xì)胞以特殊的機(jī)能，從而使宿主得到生長優(yōu)勢?！惨弧惩蛔冾愋蜖I養(yǎng)缺陷性的定義某一野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法在根本培養(yǎng)基上正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷性〔三〕突變的特點(diǎn)

1.不對(duì)應(yīng)性：突變的性狀與突變?cè)蛑g無直接的對(duì)應(yīng)關(guān)系.〔變量試驗(yàn)、涂布試驗(yàn)、平板影印培養(yǎng)試驗(yàn)〕

2.自發(fā)性：突變可以在沒有人為誘變因素處理下自發(fā)地產(chǎn)生.

3.稀有性：突變率低且穩(wěn)定。

4.獨(dú)立性：各種突變獨(dú)立發(fā)生，不會(huì)互相影響。

5.可誘發(fā)性：誘變劑可提高突變率。

6.穩(wěn)定性：變異性狀穩(wěn)定可遺傳。

7.可逆性：原始的野生基因到變異株的突變稱為正向突變，相反的過程那么稱為回復(fù)突變或回變。2、誘變育種的原那么〔1〕使用簡便有效的誘變劑誘變劑物理因素化學(xué)因素紫外線激光離子束X射線r射線快中子〔2〕選用優(yōu)良的出發(fā)菌株〔3〕處理單細(xì)胞或單孢子懸浮液〔4〕使用最正確誘變劑量劑量=強(qiáng)度〔濃度〕×作用時(shí)間相對(duì)劑量=殺菌率〔5〕利用協(xié)同效應(yīng)〔6〕尋找和利用形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)〔7〕設(shè)計(jì)高效率篩選方案〔8〕根據(jù)具體情況創(chuàng)造新型篩選方案3、突變株的篩選：〔1〕產(chǎn)量突變株的篩選〔2〕抗藥性突變株的篩選〔3〕營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選突變株的篩選方法誘變檢出營養(yǎng)缺陷型淘汰野生型富集培養(yǎng)〔抗生素法〕〔菌絲過濾法〕夾層培養(yǎng)法限量補(bǔ)充培養(yǎng)法逐個(gè)檢出法影印平板法生長譜法確定出發(fā)菌株↓菌種的純化選優(yōu)↓←出發(fā)菌株的性能鑒定同步培養(yǎng)↓制備單細(xì)胞〔或單孢子〕懸液↓←活菌濃度測定誘變劑的選擇與確定誘變劑量的預(yù)試驗(yàn)↓誘變處理↓平板別離↓計(jì)形態(tài)變異的菌落數(shù)，計(jì)算突變率挑取疑似突變菌落純培養(yǎng)↓突變體的初步篩選↓←用簡單快捷的方法重復(fù)篩選↓←搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)選出突變體〔根據(jù)情況進(jìn)行生產(chǎn)試驗(yàn)或重復(fù)誘變處理〕誘變育種的一般步驟和方法基因突變及其機(jī)制基因工程誘變自發(fā)突變點(diǎn)突變畸變堿基置換移碼突變轉(zhuǎn)換顛換缺失添加缺失添加異位倒立重復(fù)插入1、誘發(fā)突變：物理、化學(xué)核生物的因素，提高突變率的人為的作法〔1〕堿基的置換堿基對(duì)的置換可分成兩個(gè)亞類：一類是DNA鏈上的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換，稱為轉(zhuǎn)換；另一類是DNA鏈上的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘧啶或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘌呤所置換，稱為顛換。

紫外線對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)嘧啶嘧啶二聚體UV紫外線主要通過在同鏈DNA相鄰的嘧啶間或在互補(bǔ)雙鏈間形成以共價(jià)鍵結(jié)合的胸腺嘧啶二聚體，微生物能以多種方式去修復(fù)被紫外線損作后的DNA，主要方式有兩種：1、光復(fù)活作用。由于微生物中一般都存在著光復(fù)合作用，因此，用紫外線照射菌液時(shí)都須在紅光下進(jìn)行操作處理微生物，而后在暗室或用黑布包起來培養(yǎng)。

嘧啶二聚體嘧啶光解酶2、切除修復(fù)〔暗修復(fù)作用〕一、原核生物的基因重組〔一〕轉(zhuǎn)化供體菌受體菌DNA片段受體菌直接吸收來自供體菌的DNA片段，通過交換組合把它整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌的局部遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子。進(jìn)行轉(zhuǎn)化，需要二方面必要的條件：轉(zhuǎn)化過程：①從供體菌提取出轉(zhuǎn)化因子雙鏈DNA片段；②雙鏈DNA片段與感受態(tài)受體菌的細(xì)胞外表特定位點(diǎn)結(jié)合；③在結(jié)合位點(diǎn)上，雙鏈DNA中的一條單鏈逐步降解，同時(shí)另一條鏈逐步進(jìn)入受體細(xì)胞。④進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA單鏈與受體菌染色體組上同源區(qū)段配對(duì)，而受體菌染色體組的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA單鏈所取代，于是形成了雜種DNA區(qū)段；⑤受體菌染色體進(jìn)行復(fù)制，其中雜種區(qū)段被別離成兩個(gè)，一個(gè)恢復(fù)，一個(gè)形成一個(gè)轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化過程的特點(diǎn)：a〕對(duì)核酸酶敏感；b〕不需要活的DNA供體細(xì)胞；c〕轉(zhuǎn)化是否成功及轉(zhuǎn)化效率的上下主要取決于轉(zhuǎn)化供體菌株和轉(zhuǎn)化受體菌株之間的親源關(guān)系；d〕通常情況下質(zhì)粒的自然轉(zhuǎn)化效率要低得多〔二〕轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過缺陷型噬菌體或溫和型噬菌體為媒介，將供體細(xì)菌細(xì)胞中DNA片段攜帶到受體細(xì)菌細(xì)胞中，從而使受體細(xì)菌獲得供體細(xì)菌的某些遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)媒介噬菌體的不同，轉(zhuǎn)導(dǎo)分普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩類。1．普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)由缺陷型噬菌體誤包〔而非整合〕供體細(xì)菌DNA中的任何一局部片段〔包括核外遺傳物質(zhì)在內(nèi)〕后，當(dāng)它再次感染受體細(xì)菌時(shí)，使后者獲得了這局部遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為105～108。2．局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)由溫和噬菌體侵染而形成的某一溶源細(xì)菌群被誘導(dǎo)裂解時(shí)，其中極少數(shù)個(gè)體的DNA可能與噬菌體DNA發(fā)生假設(shè)干特定基因的交換，從而被整合到噬菌體的基因組上，當(dāng)該噬菌體再次感染受體細(xì)菌時(shí)，就使受體細(xì)菌獲得了這一特定遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，它的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為10-6?！踩辰雍贤ㄟ^供體細(xì)菌和受體細(xì)菌完整細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的過程，稱為接合〔有時(shí)也稱雜交〕。在細(xì)菌中，接合現(xiàn)象研究最清楚的是大腸桿菌。發(fā)現(xiàn)能夠進(jìn)行接合現(xiàn)象的大腸桿菌有雄性與雌性之分，而決定它們性別的是由是否存在F因子所決定。F因子又稱致育因子，是一種質(zhì)粒，分子量為5×107道爾頓；雌性細(xì)菌不含F(xiàn)因子，稱為F-菌株，雄性細(xì)菌含有游離存在的F因子，稱為F+菌株，當(dāng)雄性細(xì)菌細(xì)胞中所含的F因子被整合在細(xì)胞核的DNA上，不呈游離狀態(tài)存在稱為Hfr菌株〔高頻重組菌株〕；有時(shí)被整合在細(xì)胞核DNA上的F因子，從DNA上面脫落下來，呈游離存在，但在脫落時(shí)，F(xiàn)因子有時(shí)能帶一小段細(xì)胞核DNA。我們將這種含有游離存在的但又帶有一小段細(xì)胞核DNA的F因子的細(xì)菌稱為F′菌株。a〕F+細(xì)菌通過性毛與F-細(xì)菌接觸并發(fā)生相互作用；b〕F+細(xì)菌的F因子出現(xiàn)缺口，雙鏈之一被切斷，從斷端轉(zhuǎn)移F因