第五章 生物信息的傳遞（上）-轉(zhuǎn)錄

第三章生物信息的傳遞〔上〕Transcription——從DNA到RNARNA充當(dāng)信使的證據(jù)DNA與RNA的比較●根本概念●轉(zhuǎn)錄起始：RNA聚合酶、啟動(dòng)子●轉(zhuǎn)錄的根本過程●轉(zhuǎn)錄后加工●原核生物與真核生物mRNA的特征比較●RNA合成與DNA合成異同點(diǎn)Contents思考題？一、根本概念與根本特征基因轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的。它是指以DNA的一條鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)配對原那么，合成RNA的過程。轉(zhuǎn)錄RNADNA

轉(zhuǎn)錄(transcription)

：參與轉(zhuǎn)錄的物質(zhì)原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的場所：細(xì)胞核〔真核生物〕轉(zhuǎn)錄的條件：需要酶和ATP(解旋酶和RNA聚合酶〕，以及其他蛋白質(zhì)因子轉(zhuǎn)錄的結(jié)果：mRNARNA合成方向：5'3'轉(zhuǎn)錄的不對稱性：

在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。編碼鏈與模板鏈與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈，即有義鏈(sensestrand)；將另一條根據(jù)堿基互補(bǔ)原那么指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈，即反義鏈(antisensestrand)。模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一條單鏈上轉(zhuǎn)錄方向5

3

3

5

模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向DNA分子上轉(zhuǎn)錄出RNA的區(qū)段，稱為結(jié)構(gòu)基因。結(jié)構(gòu)基因：轉(zhuǎn)錄單元〔transcriptionunit〕一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列?！惨弧砇NA聚合酶〔二〕啟動(dòng)子(promoter)二、參與轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵酶與元件〔一〕RNA聚合酶●原核生物RNA聚合酶〔大腸桿菌為例〕全酶(holoenzyme)=核心酶(coreenzyme)+σ因子σ亞基：識別啟動(dòng)子，起始轉(zhuǎn)錄。σ亞基和其他肽鏈的結(jié)合不很牢固，易脫離全酶。核心酶：全酶脫離σ亞基剩下的β‘βα2ω稱為核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸間磷酸二酯鍵的形成。β亞基：是酶和底物結(jié)合的部位和催化位點(diǎn)。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通過結(jié)合β亞基，對全酶有強(qiáng)烈的抑制作用，抑制RNA合成的起始，但不抑制其延長。β亞基基因rpoB突變可使細(xì)菌對利福平有抗性。鏈霉溶菌素(streptolydigin)能抑制RNA鏈的延長，rpoB突變卻可使細(xì)胞對鏈霉溶菌素亦發(fā)生抗性。β‘亞基：其作用是與模板DNA相結(jié)合。β’亞基的堿性較強(qiáng)，適于與模板DNA相結(jié)合。肝素是一種多價(jià)陰子，能和β‘亞基結(jié)合，從而抑制DNA與RNA聚合酶相結(jié)合，進(jìn)一步抑制轉(zhuǎn)錄作用。α亞基：功能現(xiàn)尚未知。然而，當(dāng)噬菌體T4感染E.coli時(shí)，其α亞基即在精氨酸上被ADP-核糖化。這種修飾作用使該RNA聚合酶全酶對其原先識別的啟動(dòng)子的親和力減弱。所以有人認(rèn)為，α亞基的功能可能是識別其相應(yīng)的啟動(dòng)子。大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能αrpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動(dòng)子識別βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多種σ因子，用于識別不同的啟動(dòng)子原核生物RNA聚合酶的作用識別啟動(dòng)子。主要依賴于亞基，亞基只參與轉(zhuǎn)錄的起始，并決定轉(zhuǎn)錄的方向。與DNA結(jié)合并使之解鏈，另外還具有解旋、重新使DNA螺旋化作用。催化RNA聚合反響。負(fù)責(zé)三種RNA合成。RNA聚合酶核心酶通過與不同的亞基結(jié)合，識別不同的啟動(dòng)子。2.真核生物RNA聚合酶細(xì)菌只有一種RNA聚合酶，它完成細(xì)胞中所有RNA的合成。真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)更加復(fù)雜。真核細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生三種RNA聚合酶，位于不同的部位，且均有復(fù)雜的亞基結(jié)構(gòu)。每種酶負(fù)責(zé)不同種類基因的轉(zhuǎn)錄。它們的一般性質(zhì)見下表。酶位置轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相對活性對α-鵝膏蕈堿的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核質(zhì)hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核質(zhì)tRNA約10%存在物種特異性真核細(xì)胞的三種RNA聚合酶特征比較RNA聚合酶Ⅰ的活性最顯著。位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA基因(rDNA)，細(xì)胞內(nèi)絕大局部是rRNA。其活性不被α-鵝膏蕈堿所抑制。RNA聚合酶Ⅱ位于核漿中，負(fù)責(zé)hnRNA的合成。hnRNA是mRNA的前體。其活性可被低濃度的α-鵝膏蕈堿所迅速抑制，RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。聚合酶Ⅲ對α-鵝膏蕈堿的反響那么不盡相同：在動(dòng)物細(xì)胞中聚合酶Ⅲ可被高濃度α-鵝膏蕈堿所抑制，而在酵母和昆蟲細(xì)胞中那么不會(huì)被抑制。RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時(shí)進(jìn)行外切酶活性無5’3’，3’5’校對合成能力無有修復(fù)能力無有某些常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑

抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細(xì)菌的全酶與β亞基結(jié)合，阻止起始鏈霉溶菌素細(xì)菌的核心酶與β亞基結(jié)合，阻止延長放線菌素D真核RNA聚合酶Ⅰ與DNA結(jié)合，阻止延長α-鵝膏蕈堿真核RNA聚合酶Ⅱ與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合〔二〕啟動(dòng)子(promoter)啟動(dòng)子：指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。原核生物啟動(dòng)子特性在基因表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄起始是關(guān)鍵，基因是否能表達(dá)決定于在特定的啟動(dòng)子起始過程。只有RNA聚合酶能夠特異性地與啟動(dòng)子相結(jié)合。σ亞基起識別作用，沒有σ時(shí)，核心酶偶而亦能起始RNA的合成，但有許多起始錯(cuò)誤，而且核心酶所合成的RNA鏈的起始在某個(gè)基因的兩條鏈上是隨機(jī)的。但當(dāng)σ存在時(shí)，那么起始在正確的位點(diǎn)上。

RNA聚合酶能否與啟動(dòng)子相互作用是起始轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵問題。不同啟動(dòng)子對RNA聚合酶的親和力各不同?？赡軐φ{(diào)控轉(zhuǎn)錄起始的頻率，即對基因表達(dá)的程度有重要不同。

一類是RNA聚合酶可以直接識別的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子應(yīng)當(dāng)總是能被轉(zhuǎn)錄。但實(shí)際上也不都如此，外來蛋白質(zhì)可對其有影響，即該蛋白質(zhì)可直接阻斷啟動(dòng)子，也可間接作用于鄰近的DNA結(jié)構(gòu)，使聚合酶不能和啟動(dòng)子結(jié)合。另一類啟動(dòng)子在和聚合酶結(jié)合時(shí)需要有蛋白質(zhì)輔助因子的存在。這種蛋白質(zhì)因子能夠識別與該啟動(dòng)子順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。1〕兩類不同的啟動(dòng)子為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動(dòng)子處結(jié)合呢?RNA聚合酶分子上可能有一個(gè)活性中心能夠識別出DNA雙螺旋上某特異序列的化學(xué)結(jié)構(gòu)；啟動(dòng)子處的核苷酸順序具有特異的形狀以便與RNA聚合酶結(jié)合，就好似酶與其底物的結(jié)構(gòu)相恰恰適合一樣。2〕啟動(dòng)子的共同順序啟動(dòng)子的共同順序啟動(dòng)子的共同順序

TATA區(qū)：(又稱為-10序列或Pribnow盒)酶的緊密結(jié)合位點(diǎn)〔富含AT堿基，利于雙鏈翻開〕-10序列的突變不影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的速度，但會(huì)降低雙鏈解開的速度。

TATA盒決定著轉(zhuǎn)錄的方向。-35序列是RNA聚合酶全酶的識別位點(diǎn)，對全酶有很高的親和性。如果-35序列發(fā)生突變或缺失，將大大降低對全酶的親和性，即降低RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合速度，但不影響轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA雙鏈的解開。TTGACA區(qū)〔又稱-35序列〕

提供了RNA聚合酶全酶識別的信號編碼鏈AACTGTATATTA模板鏈TTGACATATAAT3’5’DNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)Probnow盒子啟動(dòng)子

35

10

+1轉(zhuǎn)錄區(qū)5’3’RNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)與新生RNA鏈第一個(gè)核甘酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基。大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動(dòng)子區(qū)T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A50T96典型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)

-35-10轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp原核生物亦有少數(shù)啟動(dòng)子缺乏這兩個(gè)序列〔-35和-10)之一。在這種情況下，RNA聚合酶往往不能單獨(dú)識別這種啟動(dòng)子，而需要有輔助蛋白質(zhì)的幫助。E.coliRNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的過程可分為兩步：①酶識別啟動(dòng)子，并與其結(jié)合形成“關(guān)閉〞復(fù)合體(即雙螺旋形式)。這一步所識別的是-35序列。②“關(guān)閉〞復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)椤伴_放〞復(fù)合體(即雙螺旋解旋，兩條鏈分開)，此時(shí)酶的結(jié)合比較緊密。在這個(gè)轉(zhuǎn)變中，富含AT堿基對的-10區(qū)約有17bp被解旋，暴露出模板鏈。-10區(qū)的突變可阻礙"開放"復(fù)合體的形成。許多突變改變了-10序列中的堿基，但并未減低其AT對的水平，卻仍然能阻礙其"融化"為開放復(fù)合體，可見-10區(qū)除了要易于融化之外，還必須有特異的形狀，以便RNA聚合酶能夠識別它。

RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合模式圖●真核生物啟動(dòng)子真核有三種不同的啟動(dòng)子和有關(guān)的元件啟動(dòng)子Ⅱ最為復(fù)雜，它和原核的啟動(dòng)子有很多不同又稱rRNA基因啟動(dòng)子或Ⅰ型啟動(dòng)子。不同真核生物Ⅰ型啟動(dòng)子序列有較大的差異，缺乏保守性。目前發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)區(qū)域是轉(zhuǎn)錄必需的：-40~+5近啟動(dòng)子局部：為核心序列，其功能是決定轉(zhuǎn)錄起始的精確位置。這一段序列的全部或局部缺失，被同樣長度的寡聚核苷酸替代，在選擇性位點(diǎn)作單個(gè)堿基突變等變化，都會(huì)消除或強(qiáng)烈降低rDNA轉(zhuǎn)錄能力。-165~-40遠(yuǎn)啟動(dòng)子局部：又稱上游控制元件(UCE)，其功能是影響轉(zhuǎn)錄的頻率。這段序列受到缺失、置換、插入等破壞，可造成轉(zhuǎn)錄下降100倍。1〕RNA聚合酶Ⅰ啟動(dòng)子又稱蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子或Ⅱ型啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子有四個(gè)區(qū)域?qū)D(zhuǎn)錄起始和活性起著調(diào)控作用，是真核基因轉(zhuǎn)錄不可缺少的。①轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：其堿基大多為A，兩側(cè)各有假設(shè)干個(gè)嘧啶核苷酸：YAYTCYYY。該序列對啟動(dòng)子的強(qiáng)度和確定起始位點(diǎn)方面都是必要的。②TATA盒：位于-25~-30bp左右，是核心序列，又稱Hognessbox。其共有序列：T85A97T93A85(A63/T37)A83(A50/T37)根本上由AT組成，極少數(shù)啟動(dòng)子中有GCbp。2〕RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子TATA盒的作用在于決定轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)，序列的改變會(huì)是轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)偏移；缺失TATA盒，轉(zhuǎn)錄將在許多位點(diǎn)上開始。TATA盒決定轉(zhuǎn)錄的效率：如雞蛋清蛋白基因啟動(dòng)子的TATA變?yōu)門AGA后，轉(zhuǎn)錄效率大大下降；兔珠蛋白中TATA盒是ATAAAA，人工突變?yōu)锳TGTAA后，轉(zhuǎn)錄效率下降80%；人的-珠蛋白基因的ATAAAA序列變?yōu)锳TGAAA、ATACAA或ATAGAA，-珠蛋白的產(chǎn)量大大降低，引起地中海貧血癥。少數(shù)蛋白質(zhì)基因缺乏TATA盒，如腺病毒DNA結(jié)合蛋白〔27KD〕基因的上游沒有TATA盒。③上游調(diào)控區(qū)〔UPE〕：真核Ⅱ型啟動(dòng)子上游具有多種調(diào)控元件：CAAT盒：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游70-80bp處的CAAT順序。這一順序具有較保守的共同順序：GGC/TCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以識別一順序。用人工方法誘導(dǎo)兔β珠蛋白基因CAAT順序發(fā)生突變，兔β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平降低。GC盒：位于CAAT盒鄰近，共同順序：GGGCGG。此外，在不同的啟動(dòng)子上還有其它類型的UPE，他們是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的位點(diǎn)，影響著轉(zhuǎn)錄活化和頻率。④遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)：在真核生物中，有些基因的啟動(dòng)子遠(yuǎn)上游區(qū)域〔-100bp以上〕可大大增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，這種序列稱為增強(qiáng)子。增強(qiáng)子有兩個(gè)特征：與啟動(dòng)子的相對位置不固定，而能有很大的變動(dòng)；b.能在兩個(gè)方向產(chǎn)生作用。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激在它附近的任一啟動(dòng)子。首先被發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子是SV40增強(qiáng)子。SV40增強(qiáng)子由兩個(gè)72bp重復(fù)串連而成，約在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游200bp處，即－107~－178和－179~－250序列。缺失實(shí)驗(yàn)顯示兩個(gè)重復(fù)缺失一個(gè)并不產(chǎn)生什么影響，如兩個(gè)均缺失即將大大降低活體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。有人發(fā)現(xiàn)，如果將β珠蛋白基因放在含有72bp重復(fù)的DNA分子中，它的轉(zhuǎn)錄作用在活體內(nèi)將增高約200倍以上，甚至當(dāng)此72bp順序位于離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游1400bp或下游3000bp時(shí)仍有作用。各個(gè)基因中的增強(qiáng)子順序差異較大，但有一個(gè)根本的核心順序(coresequence)：AAAGGTGTGGGTTTGGRNA聚合酶Ⅲ能識別各種各樣不同的啟動(dòng)子順序，當(dāng)然，還是要依靠一些輔助因子。例如，RNA聚合酶Ⅲ在轉(zhuǎn)錄爪蟾的5SRNA基因時(shí)，需要一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，37KD的蛋白質(zhì)TFⅢA的協(xié)助。TFⅢA結(jié)合在+45到+96的部位。它有雙重作用(另外一個(gè)作用是在卵母細(xì)胞中與5SRNA相結(jié)合)。另外還需要兩個(gè)因子(TFⅢB和TFⅢC)，但這兩個(gè)因子對所有第Ⅲ類基因的轉(zhuǎn)錄都需要的。而TFⅢA那么是對5S基因?qū)Ｒ坏摹?〕RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子

在枯草桿菌(Bacillussubtilis)中首次發(fā)現(xiàn)不同啟動(dòng)子需要不同σ因子。細(xì)胞中存在主要的σ因子，識別主要啟動(dòng)子。此外，還有另外一些σ因子，能夠識別另一些啟動(dòng)子，并促使核心酶起始轉(zhuǎn)錄。這些變異的σ因子在細(xì)胞中有特別功能，通常能劇烈改變細(xì)胞RNA的合成方式，以便在需要時(shí)使一組全新的基因得以表達(dá)。噬菌體往往有其自己的σ因子，借以在噬菌體發(fā)育的某一特殊階段開動(dòng)其所需要的某些噬菌體基因的轉(zhuǎn)錄。不同啟動(dòng)子需要不同σ因子E.coli細(xì)胞中正常的σ因子稱為σ70(表示其分子量為70KD)。E.coli中有17個(gè)熱休克基因，其基因表達(dá)依賴于基因htpR，受熱休克反響所誘導(dǎo)。hrpR的產(chǎn)物是一個(gè)很不穩(wěn)定的32KD蛋白質(zhì)，它就是一種變異的σ因子，稱為σ32。σ32能引導(dǎo)核心酶在熱休克基因的啟動(dòng)子處起始轉(zhuǎn)錄。σ70和σ32識別的啟動(dòng)子的順序是不同的。特別是其-10順序幾乎完全不同。

E.coli另一種σ因子是在氮饑餓時(shí)起作用的，稱為σ60。正常時(shí)E.coli細(xì)胞中僅有少量σ60，但當(dāng)介質(zhì)中氨缺乏時(shí)，σ60大量增多，以開啟某些可利用其他氮源的基因。這就是說，σ60能引導(dǎo)核心酶識別啟動(dòng)子的另一種共同順序。

σ60所識別的-35順序?qū)嶋H上位于-20處，因?yàn)?10和-35順序之間的間距特別短，只有6bp。E.coli的不同σ因子識別不同的共同順序因子基因功用-35順序間隔距離-10順序σ70rpoD正常狀態(tài)TTGACA10-18bpTATAATσ32rpoH熱休克CNCTTGAA13-15bpCCCCATNTσ60rpoN氮的利用CTGGNA6bpTTCGA

枯草桿菌正常σ因子(相當(dāng)于σ70)稱σ43，它能識別σ70所識別的共同順序。從一組基因表達(dá)變換為另一組基因表達(dá)往往需要更換σ因子。

B.subtilis在芽孢形成中產(chǎn)生新的σ因子：在芽孢形成期開始時(shí)σ43即被σ37所取代。芽孢形成開始時(shí)，在σ37的指導(dǎo)下，RNA聚合酶即能轉(zhuǎn)錄第一組芽孢形成基因。σ37分子較σ43略小。它在營養(yǎng)型細(xì)胞中即已存在，但為量很少，而且也不和核心酶結(jié)合形成全酶。在芽孢形成開始后4h，σ29開始出現(xiàn)。它指導(dǎo)另一組新基因的轉(zhuǎn)錄。σ29不存在于營養(yǎng)型細(xì)胞中，故可能是芽孢形成基因在σ37轉(zhuǎn)錄下的表達(dá)產(chǎn)物。

目前尚不了解這種替代如何調(diào)控的，現(xiàn)在認(rèn)為機(jī)制可能很復(fù)雜，牽涉到其他好幾種蛋白質(zhì)。這種替代并不完全，而且被替代下的σ43也未完全被滅活。大約還有10%的核心酶仍和σ43相結(jié)合，可能還有某些營養(yǎng)型酶在芽孢形成時(shí)仍存在于細(xì)胞中。在營養(yǎng)型細(xì)胞中存在一種σ32。它在芽孢形成早期出現(xiàn)活性，指導(dǎo)某些啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。其含量極少，不到1%。在營養(yǎng)型細(xì)胞中還有一種σ28，它的量不多，僅代表RNA聚合酶總活性的一小局部，而在芽孢形成開始時(shí)即告失活。然而奇怪的是，在某些不能形成芽孢的突變株中，是找不到它的活性的。所以有人認(rèn)為，σ28是表示營養(yǎng)已用竭，應(yīng)當(dāng)開始芽孢形成反響的信號系統(tǒng)的一個(gè)局部。真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)核心啟動(dòng)子〔corepromoter〕上游啟動(dòng)子元件〔upstreampromoterelement，UPE〕1、核心啟動(dòng)子●定義：指保證RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游TATA區(qū)●作用：選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，保證精確起始TATA

常在-25bp左右，相當(dāng)于原核的-10序列T85A97T93A85A63A83A502、上游啟動(dòng)子元件●包括CAAT盒〔CCAAT〕和GC盒〔GGGCGG〕等●作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。CAAT：-70--80bpGGGCGG：-80--110bp①啟動(dòng)子的效率各啟動(dòng)子的效率是不一樣的，效率好的啟動(dòng)子可以使RNA轉(zhuǎn)錄重復(fù)的更快一些。即啟動(dòng)子開始與酶結(jié)合和開放型復(fù)合物的形成速度，在各啟動(dòng)子之間不一樣。有的啟動(dòng)子需要10min以上才啟動(dòng)一次，有的僅1~2s內(nèi)啟動(dòng)一次。啟動(dòng)子的啟動(dòng)速率是根本的限速步驟，在這一步驟的根底上，基因表達(dá)的速度就確定了。即使是同一基因，其轉(zhuǎn)錄效率也是不固定。在不同的生長情況下轉(zhuǎn)錄可根據(jù)需要而改變。啟動(dòng)子的效率及影響因素E.coli轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)常常是通過調(diào)節(jié)蛋白的介導(dǎo)。調(diào)節(jié)蛋白與啟動(dòng)子或啟動(dòng)子附近的序列相結(jié)合，從而增高或降低RNA聚合酶起始的效率。調(diào)節(jié)蛋白有：阻遏蛋白(repressor)：能阻斷RNA聚合酶的結(jié)合，從而抵抗轉(zhuǎn)錄；激活蛋白(activator)：能與RNA聚合酶結(jié)合并提高其活性。②調(diào)節(jié)蛋白對啟動(dòng)子的影響

凡需要激活蛋白才能充分發(fā)揮作用的啟動(dòng)子常常與-35順序很不相似，這提示激活蛋白可以取代這個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。作為一種啟動(dòng)子的阻遏蛋白可能是另一種啟動(dòng)子的激活蛋白，反之亦然，這取決于其結(jié)合位點(diǎn)的準(zhǔn)確位置。一種調(diào)節(jié)蛋白的名稱常常只是反映了它第一次被發(fā)現(xiàn)時(shí)的功能。②調(diào)節(jié)蛋白對啟動(dòng)子的影響影響啟動(dòng)子功能的調(diào)節(jié)蛋白蛋白質(zhì)對啟動(dòng)子的影響在細(xì)胞中的功能乳糖阻遏蛋白阻遏作用阻止代謝乳糖的酶的合成(當(dāng)乳糖不存在時(shí))半乳糖阻遏蛋白阻遏作用阻止代謝半乳糖的酶的合成(當(dāng)半乳糖不存在時(shí))LexA阻遏蛋白阻遏作用阻止DNA修復(fù)酶的合成(當(dāng)細(xì)胞DNA未受到損傷時(shí))λ阻遏蛋白阻遏作用(啟動(dòng)子PL和PR)阻止λ生命周期中裂解期需酶的合成λ阻遏蛋白激活作用(啟動(dòng)子PRM)通過激活自身啟動(dòng)子而增加其本身的合成影響啟動(dòng)子功能的調(diào)節(jié)蛋白蛋白質(zhì)對啟動(dòng)子的影響在細(xì)胞中的功能CAP蛋白激活作用當(dāng)葡萄糖不存在時(shí)，增加代謝其他糖類的酶的合成CAP蛋白阻遏作用調(diào)節(jié)本身的基因，并阻止在葡萄不存在時(shí)所不需要的蛋白質(zhì)的合成AraC蛋白激活作用當(dāng)阿拉伯糖存在時(shí)，增加利用阿拉伯糖所需要的蛋白質(zhì)的合成AraC蛋白阻遏作用阻止代謝阿拉伯糖的酶的合成(當(dāng)阿拉伯糖不存在時(shí))λcⅡ蛋白激活作用增加建立溶源狀態(tài)所需的噬菌體蛋白質(zhì)的合成

RNA聚合酶首先要在啟動(dòng)子處使DNA解旋才能起始轉(zhuǎn)錄。因此，DNA模板的超螺旋張力對啟動(dòng)子效率有影響，凡有利或不利于解旋的情況就會(huì)增高或降低起始的頻率。

DNA旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)能使細(xì)菌的DNA保持超螺旋狀態(tài)，故有利于解旋。DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制劑萘啶酮酸可以抑制許多基因的表達(dá)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ能阻止負(fù)超螺旋。編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的基因發(fā)生突變時(shí)可增強(qiáng)某些基因的表達(dá)。③模板的超螺旋張力對啟動(dòng)子效率的影響但是，增加負(fù)超螺旋不一定就會(huì)增強(qiáng)啟動(dòng)子的功能，對某些啟動(dòng)子可能正好相反。這可能在于負(fù)超螺旋改變了啟動(dòng)子的微細(xì)構(gòu)象，抑制了RNA聚合酶的功能。詳細(xì)的機(jī)制還不明了，旋轉(zhuǎn)酶基因的啟動(dòng)子本身據(jù)信就有這樣的特性。這是有利于調(diào)節(jié)負(fù)超螺旋程度的：當(dāng)細(xì)胞DNA的負(fù)超螺旋到達(dá)足夠的程度時(shí)，DNA旋轉(zhuǎn)酶的合成就會(huì)自動(dòng)放慢。此外，某些啟動(dòng)子對超螺旋張力很敏感，而另一些那么不很敏感。可能性之一是每個(gè)啟動(dòng)子對超螺旋的依賴程度不同，這取決于其不同的順序。某些啟動(dòng)子的順序易于融化(故較不依賴于超螺旋)，而另一些的順序較難融化。另一種說法是細(xì)菌染色體的不同區(qū)域本來就有不同程度負(fù)超螺旋，因此，啟動(dòng)子處于染色體的什么區(qū)域就是一種重要因素。原核生物RNA聚合酶具有很大的全能性，幾乎不依賴任何其他蛋白質(zhì)。但是，真核生物RNA聚合酶不具有全能性，需要依賴于一系列蛋白因子才能識別和結(jié)合到啟動(dòng)子特定序列上，并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。真核生物基因轉(zhuǎn)錄必需的蛋白因子統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)錄因子。目前已經(jīng)別離純化或鑒定的轉(zhuǎn)錄因子有數(shù)百種，分為兩類：a.普遍性轉(zhuǎn)錄因子：結(jié)合與啟動(dòng)子及鄰近的序列。b.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子：結(jié)合與上游調(diào)控區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。④轉(zhuǎn)錄因子對啟動(dòng)子的影響

上游序列在某些時(shí)候可作為一些激活劑的結(jié)合部位，直接激活RNA聚合酶；上游序列和拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合，誘導(dǎo)DNA形成有利的超螺旋狀態(tài)，有利RNA合成；上游序列促使RNA聚合酶能更好地接近啟動(dòng)子區(qū)段，或使DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合固定在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上；上游序列可影響-10和-35區(qū)的DNA結(jié)構(gòu)。⑤上游DNA序列可增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性

轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物●原核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物

轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄復(fù)合體TBPTAFsTFIIATFIIBTFIIFPolIITFIIERNApolⅡ的轉(zhuǎn)錄起始●真核生物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄的根本過程1、起始位點(diǎn)的識別：RNA聚合酶與啟動(dòng)子DNA雙鏈相互作用并與之相結(jié)合的過程。

因子能識別啟動(dòng)子，并識別有義鏈，它與核心酶結(jié)合，引導(dǎo)核心酶定位到啟動(dòng)子部位。

2、轉(zhuǎn)錄起始RNA鏈上第一個(gè)核甘酸鍵的產(chǎn)生標(biāo)志著轉(zhuǎn)錄起始當(dāng)聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上后，在啟動(dòng)子附近將DNA局部解鏈，約解開17個(gè)堿基對。〔酶與啟動(dòng)子結(jié)合的部位是AT富集區(qū)，有利于解鏈〕第一個(gè)核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)結(jié)合到全酶上，形成“啟動(dòng)子-全酶-核苷三磷酸〞三元起始復(fù)合物。第二個(gè)核苷酸參入，連結(jié)到第一個(gè)核苷酸的3'羥基上，形成了第一個(gè)磷酸二酯鍵。因子從全酶上掉下，又去結(jié)合其它的核心酶。3、RNA鏈的延伸●

亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移，方向?yàn)镈NA模板鏈的3′→5′，同時(shí)將核苷酸逐個(gè)加到生長的RNA鏈的3'-OH端，使RNA鏈以5′→3′方向延伸。●在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。核心酶

····DNA

····RNA4、轉(zhuǎn)錄終止終止子〔terminator〕：基因編碼區(qū)下游使RNA聚合酶終止mRNA合成的密碼子?！駨?qiáng)終止子－內(nèi)部終止子●弱終止子－需要ρ因子〔rhofactor〕又稱為ρ依賴性終止子〔Rho-dependentterminator〕不依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄的終止

DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號，也是特定的核苷酸序列，稱為終止子。

RNA聚合酶可以識別終止子，它在一種蛋白因子的幫助下，終止轉(zhuǎn)錄，放出RNA鏈；有時(shí)，RNA聚合酶不需要蛋白因子的幫助即可終止轉(zhuǎn)錄。核心酶釋放了RNA后，也離開DNA。

DNA上的解鏈區(qū)重新形成雙螺旋。兩類終止子共同的序列特征在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)前有一段回文序列?；匚男蛄械膬蓚€(gè)重復(fù)局部(每個(gè)7～20bp)由幾個(gè)不重復(fù)的bp節(jié)段隔開?；匚男蛄械膶ΨQ軸一般距轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)16～24bp。不依賴

因子的終止終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對稱區(qū)〔回文序列〕，RNA形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；在回文序列的下游方向又常有6～8個(gè)AT堿基對(在模板鏈上為A、在mRNA上為U)；兩類終止子的不同點(diǎn)發(fā)夾式結(jié)構(gòu)和寡聚U的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。

終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，長度效率依賴

因子的終止

因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。依賴ρ因子終止子中回文序列的GC對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特征，其AT對含量比前一種終止子低。轉(zhuǎn)錄的根本過程轉(zhuǎn)錄的抗終止由于不同的生理要求，在轉(zhuǎn)錄過程中有時(shí)即使遇到終止信號，仍然需要繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，于是出現(xiàn)了抗終止現(xiàn)象。抗終止是細(xì)菌操縱子和噬菌體在調(diào)控回路中對轉(zhuǎn)錄進(jìn)行的調(diào)控?？罐D(zhuǎn)錄終止的兩種方式：1.破壞終止位點(diǎn)RNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)；2.依賴于蛋白因子的轉(zhuǎn)錄抗終止。不管原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都是以初級轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的RNA分子。然而絕大數(shù)原核生物的mRNA卻不需加工，仍為初級轉(zhuǎn)錄本的形式。相反，真核生物從斷裂基因產(chǎn)生的mRNA要經(jīng)過復(fù)雜的加工歷程，包括去除內(nèi)含子的剪接反響(splicing)。RNA的加工和成熟包括三個(gè)方面：①RNA的一般加工過程〔5’端加帽和3’端加尾〕②RNA的剪接作用③RNA的編輯作用RNA的加工和成熟真核生物mRNA前體稱為hnRNA，又稱類似DNA的RNA(D-RNA)。由hnRNA加工為成熟的mRNA，經(jīng)歷以下過程：①5′端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)5’端的一個(gè)核苷酸總是7-甲基鳥核苷三磷酸〔m7Gppp〕，mRNA5’端的這種結(jié)構(gòu)稱為帽子〔cap〕。有三類：帽子0：m7G5′ppp5′X單細(xì)胞生物〔如酵母〕帽子1：m7G5′ppp5′Xm多細(xì)胞生物，主要形式帽子2：m7G5′ppp5′XmpYm占10~15%真核生物mRNAs的加工

帽子結(jié)構(gòu)功能：①能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；②m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5’末端，以保護(hù)mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。真核生物mRNAs的加工②3’端加尾：由一種360KD特異性酶切除3′末端一段后，經(jīng)RNA末端腺甘酸轉(zhuǎn)移酶催化加上polyA尾巴〔約200個(gè)A〕。PolyA的功能：可能在于增加mRNA的穩(wěn)定性。真核生物mRNAs的加工多聚腺苷酸尾巴的添加AAUAAA：★準(zhǔn)確切割★加poly〔A〕真核生物mRNAs的加工m7Gppp鳥甘酸轉(zhuǎn)移酶③通過剪接除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的序列。④鏈內(nèi)部核苷酸甲基化。主要是m6A，可能對mRNA前體的加工起識別作用。真核生物mRNAs的加工

真核生物rRNA的成熟過程比較清楚。哺乳動(dòng)物的初級轉(zhuǎn)錄本是一條45SRNA鏈，約含110個(gè)甲基，是在轉(zhuǎn)錄中或剛剛轉(zhuǎn)錄好時(shí)加工上去的。45SRNA被加工成18S，5.8S和28SrRNAs。幾乎所有甲基均連接在核糖基上，在成熟的rRNAs中，這些甲基全部被保存。甲基的存在是初級轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)變成熟的rRNA的標(biāo)志。18SrRNA上大約有39個(gè)甲基是原來的，有4個(gè)是后加上去的；28SrRNA大約有74個(gè)甲基，全部是原來的。

真核生物rRNAs的加工

成熟的途徑可能多樣，因?yàn)橹虚g產(chǎn)物的長度在不同途徑中是不一樣的，然而最終產(chǎn)物都是一樣的。其中兩條途徑(HeLa途徑和L途徑)切割的位置是：①18S基因的5’那么；②18S和5.8S基因之間的間隔區(qū)(soqacer)；③5.8和28S序列之間的間隔區(qū)(5.8S序列成為一個(gè)和28SrRNA通過堿基配對相結(jié)合的小RNA)。E.coli7個(gè)編碼rRNA的操縱子稱為rrnA-G。它們在染色體上不連鎖。每個(gè)操縱子均轉(zhuǎn)錄為一個(gè)RNA前體。這些rrn操縱子的組成根本相同，均含有順序?yàn)?6S-23S-5S的三個(gè)rRNA分子。所有rrn操縱子均有雙重啟動(dòng)子：啟動(dòng)子P1：位于16S序列起始位點(diǎn)的上游約300bp處。P1可能是主要的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子P2：在P1的右方約110bp處。原核生物rRNAs的加工

加工rRNA的酶是RNaseⅢ。

在rne-細(xì)胞中缺乏成熟的rRNAs，而是30S前體。該前體在體外被RNaseⅢ切割成成熟的rRNA分子。

16S和23SrRNAs的前體分別稱p16和p23，它們分別比16S和23S略長一些。在初級轉(zhuǎn)錄本中，由于p16、p23的兩端的堿基都是互補(bǔ)的，它們分別形成很大的發(fā)夾。其發(fā)夾頂?shù)沫h(huán)非常大，分別為1600個(gè)核苷酸和2900個(gè)核苷酸。

tRNA的加工原核或真核生物中tRNA基因往往成簇存在。在原核生物中，至少某些tRNAs能一起形成操縱子，并由一個(gè)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄成一條長的前體RNA鏈。例如，T4噬菌體中8個(gè)tRNA基因組成一簇。E.coli中已找到兩個(gè)tRNA基因簇，二者均除tRNA基因外尚含有其他基因。這兩個(gè)基因簇均含有tRNATyr的基因，故命名：①tyrU簇，包括4個(gè)tRNA基因，tRNAThr，tRNAGly，和tRNATyr；②tyrT簇，那么僅包含兩個(gè)相同的基因，編碼tRNATyr。

在每個(gè)tRNA基因簇中，唯一的啟動(dòng)子常位于第一個(gè)tRNA基因之前。在最后一個(gè)tRNA基因的后面還有編碼蛋白質(zhì)的基因。在tyrU簇中是基因tutB(編碼延長因子EF-Tu的兩個(gè)基因之一)。而在tyrT簇中是編碼蛋白質(zhì)P的基因(蛋白質(zhì)P是一種類似魚精蛋白的多肽)。E.coli中參與tRNA加工的酶有：1.RNaseP：它是一種內(nèi)切核酸酶，負(fù)責(zé)切割所有tRNA分子的5’端。它是一種不尋常的酶。它由蛋白質(zhì)和RNA二者組成，分子中RNA有375個(gè)堿基長(約130KD)；而蛋白質(zhì)組分要小得多，大約只有20KD。在E.coli中，基因rnpA編碼其蛋白質(zhì)組成，而rnpB編碼RNA局部。這兩個(gè)基因相隔甚遠(yuǎn)。RNA和蛋白質(zhì)這兩個(gè)組分對RNaseP的催化活性似乎都是必須的。

2.RNaseD：它能從RNA的3‘端一個(gè)一個(gè)地切去堿基，以產(chǎn)生tRNA的真正的3’端(5‘端由RNaseP產(chǎn)生)。3.RNaseⅡ：有外切核酸酶的活性，它能夠?qū)RNA完全分解完。以前認(rèn)為它也與tRNA加工有關(guān)，但目前認(rèn)為它可能僅和RNA的分解代謝有關(guān)。在細(xì)菌中有兩種tRNA前體，其區(qū)別在于其3'端的序列。Ⅰ型分子有CCA三聯(lián)體在其3‘端。但某些噬菌體編碼的Ⅱ型分子那么沒有CCA序列。當(dāng)其他堿基被一個(gè)一個(gè)從前體分子上除去后，另由稱為tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶的將CCA加到3’端上去。真核生物中可能所有的tRNA前體都屬于Ⅱ型，在成熟時(shí)都需要通過酶的作用，在其3'端加上CCA序列。RNA的剪接1.酵母tRNA的剪接RNA的剪接就是要把斷裂基因的轉(zhuǎn)錄本中的內(nèi)含子除去。酵母胞核400個(gè)tRNA基因中約有40個(gè)是斷裂基因。這些基因均只有一個(gè)內(nèi)含子，位于與反密碼子的3’側(cè)相隔一個(gè)核苷酸之處，長度為14至46bp。不同的tRNA基因中的內(nèi)含子不同，無任何可識別的共同順序。所有內(nèi)含子中均有一段反密碼子互補(bǔ)的序列，反密碼子被配對而使反密碼臂伸長了很多。在前體中僅反密碼臂受到影響，其他局部仍保持其正常結(jié)構(gòu)。酵母tRNAphe中的內(nèi)含子能與其反密碼子堿基配對，從而改變了反密碼臂的結(jié)構(gòu)。此剪切過程可分為兩個(gè)階段：第一步是磷酸二酯鍵的斷裂，這不需要ATP。這一步由一種內(nèi)切核酸酶所催化。第二步是連接反響，需要ATP的存在，由RNA連接酶所催化。在無ATP時(shí)，產(chǎn)生的兩個(gè)tRNA半分子不能連接起來。識別信號可能位于前體tRNA的外顯子中的序列和結(jié)構(gòu)。這兩個(gè)半分子具有獨(dú)特的末端：其5’端有OH基，而3’有一個(gè)2’,3’-環(huán)磷酸基。當(dāng)參加ATP時(shí)，兩個(gè)tRNA半分子先發(fā)生堿基配對，形成成熟tRNA分子的構(gòu)象，然后由RNA連接酶形成磷酸二酯鍵而將兩個(gè)半分子共價(jià)連接起來。2’,3’-環(huán)磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳動(dòng)物的tRNA剪接反響中也有環(huán)狀基團(tuán)的產(chǎn)生。在人的HeLa細(xì)胞中，RNA連接酶能將帶有2',3'-環(huán)磷酸基的RNA和另一帶有5'-OH基的RNA直接連接起來。酵母tRNA前體也可以在爪蟾的卵母細(xì)胞核提取液中正確地被剪接。這表示剪接反響沒有種屬特異性。爪蟾具有能識別酵母tRNA的內(nèi)含子的酶類。內(nèi)含子外顯子2外顯子1內(nèi)切酶5’3’外顯子1外顯子23’5’PHO激酶外顯子2外顯子2外顯子2A-P-P3’3’3’連接酶-AMP連接酶ATP內(nèi)含子P外顯子2P外顯子1POH外顯子1PP外顯子1POH3’5’5’5’AMP磷酸酯酶P環(huán)式磷酸二酯酶pre-tRNA成熟tRNA四膜蟲的兩個(gè)主要rRNAs基因的初級轉(zhuǎn)錄本稱為35S前體RNA，較小的rRNA的序列在5‘側(cè)，較大的26SrRNA序列那么在3’側(cè)。在編碼26SrRNA序列存在一個(gè)單一的，短的(約400bp)內(nèi)含子。如將這個(gè)35S前體RNA在體外溫育，可以發(fā)生自動(dòng)剪接作用:內(nèi)含子從前體中被切出，先呈線性RNA片段，后來又環(huán)化為環(huán)狀RNA。2.rRNA的剪接——自身剪接反響

某些真菌線粒體中的內(nèi)含子有很不尋常的結(jié)構(gòu)，這些內(nèi)含子有編碼順序，這些順序的翻譯對于該順序所在的內(nèi)含子的剪接是必須的。編碼細(xì)胞色素b(cytb)的box基因在僅剪去內(nèi)含子1時(shí)，會(huì)產(chǎn)生RNA成熟酶的mRNA。當(dāng)內(nèi)含子2亦被剪去時(shí)，才是cytb的編碼順序的開端。

box基因中的外顯子1有417bp，編碼cytb的N端139個(gè)密碼子。內(nèi)含子1有765bp，不編碼。外顯子2非常短，僅有5個(gè)密碼子。其后是一個(gè)很長的內(nèi)含子2，含有840bp組成的開放讀框(ORF)，有280個(gè)密碼子，其最后一個(gè)密碼子為終止密碼子。3.能夠編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)含子的剪接

當(dāng)將內(nèi)含子1剪去后，翻譯即從外顯子1起始，通讀過外顯子2而進(jìn)入內(nèi)含子2的ORF，產(chǎn)生一個(gè)有423個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(其中144個(gè)是cytb的N端氨基酸，279個(gè)那么由內(nèi)含子2編碼〕稱為RNA成熟酶(maturase)。RNA成熟酶是特異地用來剪去內(nèi)含子2的。這樣，這個(gè)酶促反響便成為一個(gè)非常敏感的負(fù)反響徑路。去除內(nèi)含子2后，外顯子1和2即與外顯子3相連接，因而破壞了編碼成熟酶的順序。生物體內(nèi)內(nèi)含子的主要類型：

GU-AG、AU-AC、Ⅰ類內(nèi)含子、Ⅱ類內(nèi)含子參與RNA剪接的物質(zhì)：snRNA〔核內(nèi)小分子RNA〕snRNP〔與snRNA結(jié)合的核蛋白〕①②③UACUACA-AGUGU4U5U6E1E2U1U2UACUACA-AGUGU6E1E2U1、U4、U5mRNA內(nèi)含子的去除必須非常精確，否那么即使只差一個(gè)核苷酸，也會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)義或移碼的蛋白質(zhì)。所以可以肯定在內(nèi)含子與外顯子連接處的核苷酸序列具有高度的相似性。剪接連接點(diǎn)(splicingjunctions)是指在切斷和重接位點(diǎn)處的兩旁的順序。在內(nèi)含子左側(cè)的連接點(diǎn)稱為供體(donor)，在內(nèi)含子右側(cè)的稱為受體(acceptor)。4.mRNA內(nèi)含子的剪接

⑴細(xì)胞核中的剪接連接點(diǎn)

正確的剪接依賴于天然前體RNA分子的完整性。一個(gè)外源基因如果存在于病毒順序中，仍能很好地被剪接。另外，前體RNA亦能在不同的組織，或甚至不同物種的細(xì)胞中被正確地剪接。這都表示剪接作用是很保守的。

一個(gè)基因的外顯子可以和另一個(gè)基因的外顯子連接。例如SV40(猴病毒40)早期轉(zhuǎn)錄單位的第1外顯子和小鼠β珠蛋白的第3外顯子相連。

剪接作用與轉(zhuǎn)錄作用、RNA的修飾無關(guān)。例如HeLa細(xì)胞的核提取液能夠剪接純化的RNA前體，珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾鏈，也沒有加帽，仍能正常地被剪接。剪接過程可分為兩個(gè)階段，核內(nèi)剪接需要ATP。在第一階段中，內(nèi)含子左端(供體位點(diǎn))處被切斷，形成兩個(gè)別離的RNA分子，即左外顯子和右內(nèi)含子-外顯子。左外顯子此時(shí)為線性分子，但右內(nèi)含子-外顯子那么不然：內(nèi)含子左端(5'端)以5'-2'鍵與在內(nèi)含子右端上游約30堿基處的CTGAC序列(共同序列)中的A相連接，于是形成一個(gè)"套索"(lariat)"。⑵剪接過程——套索的產(chǎn)生

在第二階段，在受體位點(diǎn)處被切斷而將此套索狀的內(nèi)含子剪去；同時(shí)別離的右外顯子即與左外顯子相連接。套索然后被“脫支(debranch)〞而形成一線性內(nèi)含子。在這種剪接機(jī)構(gòu)中，有三個(gè)很短的共同順序，即供體點(diǎn)、受體點(diǎn)和套索分支處的序列。供體點(diǎn)分支點(diǎn)受體點(diǎn)外顯子1…GGU……APy……AG…外顯子2

分支點(diǎn)外顯子1…G

GU……APy……AG

…外顯子2

UG

G…外顯子1

APy……AG

…外顯子2

UGG…外顯子1APy……AG

…外顯子2

外顯子1…G…外顯子2＋UG

APy……AG

剪接反響需要蛋白質(zhì)和RNA參與。①參與剪接反響的蛋白質(zhì)：有4類A.SR蛋白家族：含有S-Ser和R-Arg二肽重復(fù)序列，起調(diào)控作用。結(jié)合于多聚嘧啶束的蛋白質(zhì)：2種U2snRNP的輔助因子(U2AF)，1種多聚嘧啶束的結(jié)合蛋白(PTB)，1種與PTB相連的剪接因子(PSF).與snRNP相連的剪接蛋白D.其它剪接蛋白：帽子結(jié)合蛋白CBP；剪接體形成蛋白；催化必需的蛋白質(zhì)因子；依賴于ATP的RNA解旋酶；特異于SR蛋白的激酶。E.組成snRNPs的大量蛋白質(zhì)②參與剪接反響的RNA：U1、U2、U4、U5和U6snRNA五種。snRNA和大量蛋白質(zhì)結(jié)合組成snRNP(小核糖核蛋白顆粒)

每個(gè)真核細(xì)胞中含有105-106個(gè)小RNA，約有100~300個(gè)堿基，它們是由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ所合成的，其中某些像mRNA一樣可被加帽。

snRNA：在細(xì)胞核中，如U1~6

snRNAscRNA：在細(xì)胞漿中

snRNP：snRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，U1~6

snRNPscRNP：scRNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物(3)snRNAs的作用snRNPs的作用：和剪接作用有密切關(guān)系，有些snRNPs分別和供體及受體剪接位點(diǎn)以及分支順序相互補(bǔ)。編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因是在核漿中被轉(zhuǎn)錄的。核漿中的RNA大，很不穩(wěn)定，并且其順序的復(fù)雜性也要大得多。由于它的大小很不一致，故稱核內(nèi)不均一RNA(hnRNA)。mRNA是從hnRNA生成的。胞漿內(nèi)mRNA平均只有1800-2000個(gè)堿基。而哺乳動(dòng)物的hnRNA平均有8000-10000個(gè)堿基，其范圍很廣泛，從2000-14000堿基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍。正常哺乳細(xì)胞中mRNA僅占hnRNA量的5%，那么相當(dāng)于有25%的hnRNA可轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA。有3/4的hnRNA即在核內(nèi)降解。(4)核內(nèi)不均一RNAhnRNA被切除內(nèi)含子后即成為mRNA，并進(jìn)入細(xì)胞漿內(nèi)。但在切除內(nèi)含子之前，hnRNA可先加帽和加poly(A)尾鏈。有一種稱為poly(A)聚合酶的酶可以用ATP為底物，以加上poly(A)尾鏈，這是hnRNA轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA所必須的。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，僅約30%的hnRNA被多聚腺苷酸化，而mRNA中卻約70%是有poly(A)尾鏈的?？赡芏嗑巯佘账峄莌nRNA分子要被加工的信號。hnRNA的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。因?yàn)镽NA聚合酶在轉(zhuǎn)錄時(shí)即已通過了相當(dāng)于加上poly(A)的位點(diǎn)，故hnRNA尾端的多余局部要由內(nèi)切核酸酶切去，才能加上poly(A)。5.RNA剪接的生理作用選擇性剪接的生物學(xué)意義——一個(gè)基因可以產(chǎn)生多個(gè)蛋白質(zhì)

選擇性剪接(alternativesplicing)是指在同一個(gè)基因中，其剪接位點(diǎn)和拼接方式可以改變，從而導(dǎo)致一個(gè)基因能產(chǎn)生多個(gè)具有明顯差異的mRNA。

例1：選擇性剪接能使

-原肌球蛋白基因編碼出骨骼肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞兩種形式的蛋白質(zhì)。1a2b3c4d5e6f7g8h9i10j1112345789101234568911abcde6fghij11abcdef7ghi10j骨骼肌肉細(xì)胞中剪接平滑肌

-原肌球蛋白mRNA

-原肌球蛋白mRNA前體成纖維、平滑肌肉細(xì)胞中剪接骨骼肌

-原肌球蛋白mRNA被剪去的局部被剪去的局部

以上可見選擇性剪接在細(xì)胞分化的基因調(diào)控中起重要作用。例3：某一基因的mRNA前體在不同類型的細(xì)胞中產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。例4：粘連蛋白基因〔有3種類型的外顯子〕轉(zhuǎn)錄的mRNA前體，可被選擇性剪接成編碼20種具有不同功能的蛋白質(zhì)的mRNA。例5：抗體的形成也是RNA有選擇性剪接的結(jié)果。1234561234—poly(A)12356—poly(A)甲狀腺細(xì)胞腦細(xì)胞降鈣素mRNACGRP神經(jīng)多肽mRNA44565內(nèi)含子外顯子選擇性剪接與果蠅的性別決定

選擇性剪接除了可產(chǎn)生不同分化細(xì)胞的特異產(chǎn)物外，也參與細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控作用。如：果蠅的性別表型是由常染色體和性染色體的比例決定的，后者由性別致死基因監(jiān)控，其可通過調(diào)節(jié)mRNA前體的剪接，導(dǎo)致性別差異。在幼蟲期，轉(zhuǎn)化子基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可加工成普通的mRNA，其第二個(gè)外顯子的前面局部含有1個(gè)終止密碼子UGA；而在雌性mRNA中，此UGA被剪接掉，因此沒有干擾mRNA的翻譯。XXAA(1:1)

性別致死基因有功能雌性特異mRNA〔活性〕蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化子基因〔關(guān)鍵〕雌性特異的mRNA蛋白質(zhì)雙性基因

雌性特異的mRNA蛋白質(zhì)雌性表型XYAA(0.5:1)

性別致死基因無功能的mRNA〔沒激活〕轉(zhuǎn)化子基因〔功能喪失〕無功能的mRNA雙性基因

雄性特異的mRNA蛋白質(zhì)雄性表型剪接與病變基因突變是遺傳病的本質(zhì)，類型有：②剪接位置的點(diǎn)突變；據(jù)統(tǒng)計(jì)，在大約4000多種人類遺傳性疾病中，由剪接位置點(diǎn)突變引起的疾病占15%。如纖維性囊腫、鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥、血友病A、B、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、苯丙酮酸尿癥。①基因編碼區(qū)內(nèi)的點(diǎn)突變；剪接位置點(diǎn)突變的類型有：點(diǎn)突變造成一些隱性剪接位置的產(chǎn)生1231GU……..AG2GU………..AG3a.正常

1GU…GU…..AG2GU………..AG31231……23剪接產(chǎn)物變短剪接產(chǎn)物變長b.5′端產(chǎn)生隱形剪接位置①②②1GU…..AG…..AG2GU………..AG31231……23剪接產(chǎn)物變短剪接產(chǎn)物變長c.3′端產(chǎn)生隱形剪接位置①②②點(diǎn)突變造成原有的剪接位置消失1GU…….··2GU…AG31GU…AG2··……AG31313外顯子遺漏如:苯丙氨酸羥化酶基因的第12個(gè)外顯子遺漏引起苯丙酮酸尿癥6.RNA剪接現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1970年代以前認(rèn)為基因、mRNA和蛋白質(zhì)之間都是一種線性關(guān)系，這結(jié)果來自原核生物，并認(rèn)為具有普遍性。1960年代開始，一些學(xué)者依據(jù)生化方面的證據(jù)，對細(xì)菌基因結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機(jī)制的普遍性。產(chǎn)生了疑心：真核生物之間，其生殖細(xì)胞的DNA含量差異很大，但其基因的數(shù)量沒有明顯變化；核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的RNA與存在于細(xì)胞質(zhì)的翻譯機(jī)器呈相互分隔狀態(tài)；1963年JamesDarnell等通過放射性標(biāo)記RNA轉(zhuǎn)移區(qū)帶離心分析，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)存在一系列不均一分子，其沉降系數(shù)在20S~100S之間，稱為hnRNA。這進(jìn)一步支持了Harris的觀點(diǎn)；1962年HenryHarris采用顯微放射自顯影發(fā)現(xiàn)核內(nèi)RNA與胞質(zhì)RNA存在明顯的差異，認(rèn)為大量的核內(nèi)RNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)之前，已經(jīng)發(fā)生降解；1977年Bastos和Aviv發(fā)現(xiàn)hnRNA是mRNA的前體，又稱為前體mRNA；Darnell等又發(fā)現(xiàn)標(biāo)記hnRNA在幾小時(shí)之間迅速降解，細(xì)胞質(zhì)的mRNA僅為hnRNA的10~20%；斷裂基因概念的提出，產(chǎn)生了基因內(nèi)含子、外顯子以及RNA剪接概念。1977年，PhillipSharp等、RichardRobert等同時(shí)觀察到腺病毒DNA與其mRNA之間形成不連續(xù)的雜種分子，提出斷裂基因的概念；〔1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng)〕

真核基因結(jié)構(gòu)是有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子間隔相接而成的，再基因表達(dá)過程中發(fā)生了剪接。RNA的編輯作用RNA編輯(RNAediting)是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、參加或喪失等現(xiàn)象。RNA編輯現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)對分子生物學(xué)的一個(gè)根本原那么提出了挑戰(zhàn)，也為基因表達(dá)的修正提供了一種機(jī)制。遺傳信息是否多存在于基因序列中？指導(dǎo)編輯的遺傳信息是什么？1.RNA編輯的概念RNA編輯方式有：堿基插入、缺失和取代。出現(xiàn)編輯現(xiàn)象較多情況：方式：堿基插入生物：錐蟲細(xì)胞器：線粒體

RNA：mRNAapo-B基因〔載脂蛋白B基因〕的組織特異性表達(dá)受到RNA編輯的調(diào)節(jié)。2.RNA編輯現(xiàn)象apo-B基因〔29個(gè)外顯子〕肝細(xì)胞腸上皮細(xì)胞Apo-B100蛋白(500KD)Apo-B48蛋白(