《RNA剪切加工》課件

第6章

RNA剪切加工1精選課件ppt本次內(nèi)容1、轉(zhuǎn)錄后加工2、RNA剪切3、真核生物與原核生物mRNA比較2精選課件ppt轉(zhuǎn)錄后加工

多數(shù)轉(zhuǎn)錄的初始產(chǎn)物無生物活性，在生物體內(nèi)進行加工處理后才具有生物活性。轉(zhuǎn)錄后加工（post-transcriptionalmodification）（post-transcriptionalprocessing）:是指將各種前體RNA分子加工轉(zhuǎn)變成有功能的、成熟的各種RNA(mRNA、rRNA或tRNA等)的過程

3精選課件ppt加工的三種形式是：

①減少部分片段：如切除5’端前導(dǎo)序列，3’端尾巴和中部的內(nèi)含子；

②增加部分片段：5’加帽,3’加ploy(A)和通過編輯加入一些堿基；

③修飾：對某些堿基進行甲基化等4精選課件ppt原核生物tRNA和rRNA加工真核生物tRNA和rRNA加工1.1tRNA和rRNA的加工5精選課件ppt1.1.1tRNA加工原核生物tRNA初始轉(zhuǎn)錄本有三種（1）多數(shù)為串連在一起的多順反（polycistron）（2）少數(shù)為單順反子（3）由tRNA和rRNA串連組成原核生物tRNA和rRNA的加工6精選課件ppt7精選課件ppt原核生物有兩種類型的tRNA基因：

1、具CCA序列——Ⅰ型tRNA

CCA下游仍有一段序列，需在酶的作用下切除

2、無CCA序列——Ⅱ型tRNA

需在酶的作用下添加CCA序列8精選課件ppt9精選課件ppt10精選課件ppt（1）RNaseP(由蛋白質(zhì)和RNA組成的復(fù)合體)可切除E.coli前體tRNA5’的前導(dǎo)序列（41nt）。該酶不識別特殊的序列，而是識別二級結(jié)構(gòu)——發(fā)夾所組成的tRNA。（2）去尾，形成3’－OH末端。由內(nèi)切酶和外切酶共同參與。11精選課件ppt（3）修飾。在前體的一些專一部位的堿基需要通過甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用進行修飾成為特殊的堿基。12精選課件ppt2.rRNA的加工

在E.coli中rRNA有7個轉(zhuǎn)錄單位,每個轉(zhuǎn)錄單位含有16S、23S、5SrRNA及一個或幾個tRNA。

rRNA前體的加工由RNaseⅢ負(fù)責(zé)。13精選課件ppt14精選課件ppt15精選課件ppt16精選課件ppt真核生物tRNA和rRNA的加工1.tRNA的加工

真核tRNA的基因與原核不同：

1）真核的前體分子tRNA數(shù)目多、單順反子、成簇排列、有基因間隔區(qū)。例如：爪蟾tRNA基因數(shù)目＞200拷貝，酵母約有400個tRNA基因，是一種重復(fù)序列；

2）真核的前體分子tRNA中含有內(nèi)含子。其加工過程要剪接內(nèi)含子，都要加CCA

17精選課件ppt18精選課件ppt酵母tRNA前體的體外剪接在未處理前電泳只出現(xiàn)一條帶加入核酸內(nèi)切酶出現(xiàn)兩條帶19精選課件ppttRNA半分子tRNA半分子20精選課件ppt21精選課件ppt真核tRNA內(nèi)含子的切除和其他內(nèi)含子的切除是不同的：

1）沒有交界序列，沒有內(nèi)部引導(dǎo)序列;

2）切除是依賴于蛋白質(zhì)的RNase;3）不是轉(zhuǎn)酯反應(yīng)；

4）其剪切原則上是依賴于對tRNA共同的二級結(jié)構(gòu)的識別。22精選課件ppt23精選課件ppt

2.真核rRNA的加工

真核生物的18S、5.8S和28SrRNA基因串聯(lián)在一起形成一個轉(zhuǎn)錄本，初級轉(zhuǎn)錄本為45S前體，5SRNA與它們分開轉(zhuǎn)錄，這和原核的rRNA基因不同。

1）真核rRNA基因中沒有內(nèi)含子。

2）在轉(zhuǎn)錄時或轉(zhuǎn)錄后有110個甲基化酶立即結(jié)合導(dǎo)轉(zhuǎn)錄本上：保持到rRNA加工成熟。18SRNA結(jié)合39個甲基化酶（胞質(zhì)中加上4個）28SRNA結(jié)合74個甲基化酶表明甲基化用于標(biāo)明轉(zhuǎn)錄本的加工區(qū)域24精選課件ppt25精選課件ppt26精選課件ppt1.2前體mRNA的加工1.2.1原核前體mRNA的加工1.2.2真核前體mRNA的加工27精選課件ppt1.2.1原核前體mRNA的加工

原核生物的mRNA一般不經(jīng)過加工，由于轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)，中間沒有加工的時間。少數(shù)情況：多順反子mRNA先被內(nèi)切酶切成較小的單位再作為翻譯的模板。

28精選課件ppt29精選課件ppt1.2.2真核mRNA的加工

真核mRNA的加工一般要經(jīng)過四個步驟：

1）mRNA的5’端加帽

2）mRNA的3’端多聚腺苷酸化（加尾）

3）切除內(nèi)含子

4）修飾（對某些堿基進行甲基化）30精選課件ppt1.2.2.1

mRNA的5'加帽成熟的真核生物并沒有游離的5’端，只有所謂的帽子結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)是通過轉(zhuǎn)錄加工加上去的。mRNA的5’加帽是一個多步加工過程，第一步是鳥苷轉(zhuǎn)移酶（guanylyltransferase）將一個鳥苷酸加在5’RNA的前端，產(chǎn)生5’-5’對接的磷酸二酯鍵。第二步由鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（quaninemethyltransferase）將一個甲基基團加到嘌呤環(huán)的7位氮原子使5‘帽子鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基鳥嘌呤。1.2.2真核mRNA的加工31精選課件ppt存在于各類帽子中存在于Ⅰ類帽子中存在于Ⅱ類帽子中真核生物的帽子結(jié)構(gòu)有三類Type0cap:m7GpppXTypeⅠcap:m7GpppXmTypeⅡcap:m7GpppXmYm帽結(jié)構(gòu)的形成與甲基化位點CH3CH332精選課件pptmRNA5'加帽的功能主要表現(xiàn)在4個方面：1）保護mRNA5’端不被降解

細(xì)胞內(nèi)存在許多RNA酶（RNase），它們可攻擊游離的RNA分子。RNA酶的降解從5‘端起始，當(dāng)在mRNA的5’端加上m7GpppG帽子后，帶有3個連接磷酸的5‘帽可阻止RNase切割。2）為核糖體識別mRNA提供信號，提高翻譯效率

真核生物mRNA必須通過5'帽結(jié)合蛋白才能接觸核糖體，起始翻譯。缺少加帽的mRNA由于不能被5'帽結(jié)合蛋白識別，其翻譯效率比加帽的mRNA低二十倍。33精選課件ppt

3）作為進出細(xì)胞核的識別標(biāo)記。凡由PolII轉(zhuǎn)錄的RNA均在5‘端加帽，包括snRNA，這是RNA分子進出細(xì)胞核的識別標(biāo)記。大多數(shù)snRNA轉(zhuǎn)錄后在細(xì)胞核中接收5’端單甲基m7G加帽，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)與snRNP蛋白結(jié)合。在細(xì)胞質(zhì)中snRNA5‘帽需再修飾成為三甲基帶帽結(jié)構(gòu)m2，2，7G，隨后重新返回細(xì)胞核參與mRNA的剪接加工。U6snRNA由PolIII轉(zhuǎn)錄，在其5’端保留的三磷酸基團無帽子結(jié)構(gòu)，因而不能輸出細(xì)胞核。某些突變型中被輸送到細(xì)胞質(zhì)中的snRNA由于不能合成三甲基帶帽結(jié)構(gòu)，不能返回細(xì)胞核。4）提高mRNA的剪接效率。5‘帽結(jié)合蛋白涉及第一個內(nèi)含子剪接復(fù)合物的形成，直接影響mRNA的剪接效率。

34精選課件ppt1.2.2.2

mRNA的加尾（3’端多聚腺苷酸化）幾乎所有真核生物成熟的mRNA末端都有一串約250個腺嘌呤核苷酸尾巴。它們并非模板DNA編碼，而是在轉(zhuǎn)錄完成后由poly(A)多聚酶合成。加尾位置不在轉(zhuǎn)錄物的最末端，而是在接近末端的內(nèi)部位點。在切除mRNA3'末端的一段序列后，再加上多聚腺苷酸。真核生物mRNApoly(A)長度并非固定不變。細(xì)胞核中的poly(A)長度平均為210±20nt，細(xì)胞質(zhì)poly(A)長度190±20nt。輸送到細(xì)胞質(zhì)中的mRNA其poly(A)可由RNase切短，但又能經(jīng)細(xì)胞質(zhì)poly（A）酶重新加長，保持有限的長度。細(xì)胞質(zhì)中mRNA的poly(A)長度總的趨勢是逐漸變短，直到丟失大部分或全部poly（A），此時mRNA的壽命亦接近終點。1.2.2真核mRNA的加工35精選課件ppt加尾信號新合成的mRNA的3‘-端含兩個明顯的加尾信號。第一個加尾信號位于poly(A)上游約10

20個核苷酸處。其一致順序為5‘

AAUAAA

3’。該加尾信號中最多的變異發(fā)生在第二個堿基，其它位置的堿基代換將使Poly(A)加尾效率急劇下降。第二個加尾信號位于5'

AAUAAA

3'順序下游約15-24bp位置處，有一段富GU序列，緊隨其后通常有一串富T的順序：

5'-AAUAAA-----24bp----GTGTGTTGGAATTTTTTGTGT--3'

36精選課件pptCPSF:cleavageandpolyadenylationspecifityfactorCstF:cleavagestimulationfactor37精選課件ppt38精選課件ppt如果改變5‘

AAUAAA

3’位置，加尾位點改變。缺失5‘

AAUAAA

3’順序，則不發(fā)生加尾。富GU序列和緊隨其后的富T序列對正常的加尾不可缺一，如保留富GU順序，除去富T順序，加尾效率僅及對照的30%。如保留富T順序，除去富GU順序，加尾效率降至10%。同時缺失GU序列和富T序列，即使保留5'

AAUAAA

3'順序也不能進行加尾。此外，GU/T序列與5'

AAUAAA

3'順序的相對位置也很重要，如在5'

AAUAAA

3'順序的下游插入16bp，加尾效率只有正常的10%。如在GU序列和富T序列之間插入5bp，加尾效率喪失70%。39精選課件ppt40精選課件pptmRNA的多聚腺苷酸化mRNA的多聚腺苷酸化涉及兩個步驟，首先必須在加尾的核苷酸位置切斷RNA，然后在游離的3‘末端進行多聚腺苷酸化。有許多蛋白質(zhì)參與poly(A)的加尾事件。

1）參與Poly(A)加尾的蛋白質(zhì)稱為切割與多聚腺苷酸化專性因子（cleavageandpolyadenylationspecificityfactor,CPSF），CPSF專一性與加尾信號5’

AAUAAA

3‘結(jié)合。

2）另一個蛋白即切割激發(fā)因子CstF（cleavagestimulationfactor,CstF）特異附著在富GU區(qū)。因此CPSF和CstF實際結(jié)合的位置處于切割與多聚腺苷酸化位點兩側(cè)。CPSF或CstF單個因子與信號順序結(jié)合都是不穩(wěn)定的，只有兩者同時附著在兩個信號位置才保持穩(wěn)定狀態(tài)。

3）此外還有另兩個蛋白對RNA的切割必不可少，它們分別是切割因子I和II（cleavagefactorsIandII，CFI和CFII），可與RNA結(jié)合。poly（A）多聚酶，CFI和CFII與RNA結(jié)合的位置處于兩個加尾信號之間。雖然切割與加尾是兩個性質(zhì)不同的事件，但實際進行時幾乎同時發(fā)生，實驗設(shè)計很難將其分開。41精選課件ppt42精選課件ppt嚴(yán)格說來切割信號和加尾信號是不相同的。前體mRNA切割的位置處于5‘

AAUAAA

3’下游15-25nt之間，由切割酶專一性識別。poly（A）多聚酶只是利用已產(chǎn)生的3‘游離末端將腺苷酸逐個連接，加尾信號實際上是5’

AAUAAA

3‘以及下游一段不能少于8nt的順序。一旦mRNA前體被切斷之后，多聚腺苷酸化立即開始。多聚腺苷酸化可細(xì)分為兩個階段，首先依賴5'

AAUAAA

3'信號和與之結(jié)合的CPSF緩慢合成約10個核苷酸，然后依賴已合成的寡聚腺苷酸迅速在其末端加上200或更多個腺苷酸。43精選課件pptCleavageofthe3￠endofhistonemRNAmayrequireasmallRNA·HistonemRNAsarenotpolyadenylated;their3￠endsaregeneratedbyacleavagereactionthatdependsonthestructureofthemRNA.·ThecleavagereactionrequirestheSLBPtobindtoastem-loopstructure,andtheU7snRNAtopairwithanadjacentsingle-strandedregion.44精選課件ppt45精選課件pptpoly（A）的功能增加mRNA的穩(wěn)定性

將攜帶或缺少poly（A）的球蛋白mRNA注入到蛙卵中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6小時后缺少poly（A）的球蛋白mRNA不再進行翻譯，而攜帶poly（A）的處理仍然正常合成球蛋白。最簡單的解釋是，poly（A）有助于增加mRNA的穩(wěn)定性提高mRNA翻譯效率

mRNA的翻譯需要PABI（poly（A）bindingproteinI，poly（A）結(jié)合蛋白I）的蛋白參與，它們與poly（A）的結(jié)合可提高mRNA的翻譯效率。如果在mRNA樣品中加入過量的poly（A），可急劇降低蛋白質(zhì)合成的數(shù)量。原因在于大量poly（A）與PABI因子竟?fàn)幮越Y(jié)合，使mRNA缺少必需的PABI，因而不能有效翻譯。此外適當(dāng)延長poly（A）核苷酸數(shù)目可控制mRNA的翻譯?；罴?xì)胞中很少mRNA的poly（A）長度少于30nt，低于這一長度mRNA不能翻譯。poly（A）可影響mRNA前體最后一個內(nèi)含子的剪切，缺少poly（A）使剪接效率降低5-10倍。46精選課件ppt播放動畫:

1、mRNASplicing2、LifeCycleofanmRNA47精選課件ppt本次內(nèi)容1、轉(zhuǎn)錄后加工2、RNA剪切3、真核生物與原核生物mRNA比較48精選課件ppt1、核酶2、RNA中的內(nèi)含子3、RNA的剪切4、RNA的編輯和修飾RNA的剪接49精選課件ppt

轉(zhuǎn)錄后加工是產(chǎn)生各種成熟RNA分子的重要過程在真核生物的mRNA前體中，將內(nèi)含子（intron）去除，而把外顯子（exon）連接起來形成成熟RNA分子的過程，稱為RNA剪接（RNAsplicing）。50精選課件ppt51精選課件ppt加工過程推測的生理功能加帽反應(yīng)mRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)運輸加尾反應(yīng)轉(zhuǎn)錄終止，翻譯起始和mRNA降解RNA剪接從mRNA、tRNA和rRNA分子中切除內(nèi)含子RNA切割從前體RNA中釋放成熟tRNA和rRNARNA加工過程及其生理功能52精選課件ppt1.核酶(ribozyme)核酶(ribozyme)有的譯為核糖擬酶，核酶等。核酶是T．Cech和S．Altman(1981年)在研究四膜蟲rRNA時發(fā)現(xiàn)的，1982年T．Cech由核糖核酸(ribonucleicacid)和酶(enzyme)這兩個詞“重組”成一個新的詞：“ribozyme”。它是指本質(zhì)為RNA或以RNA為主含有蛋白質(zhì)輔基的、具有催化功能的一類物質(zhì)。53精選課件ppt一、核酶核酶和酶的區(qū)別，主要在：一般的酶是純的蛋白質(zhì)，而核酶是RNA或帶有蛋白的RNA；核酶既是催化劑又是底物，隨著反應(yīng)的進行，本身也消失了。而酶卻不同，僅催化反應(yīng)，反應(yīng)前后其本身的質(zhì)和量都不發(fā)生改變。54精選課件ppt55精選課件ppt核酶催化的反應(yīng)分為兩類：自體催化包括：①第一組內(nèi)含子的自我剪接；②第二組內(nèi)含子的自我剪切；③植物類病毒和擬病毒的自我剪切。半自體催化包括：①核mRNA內(nèi)含子的剪切；②錐蟲SLRNA的反式拼接；③tRNA5‘加工

（不屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)內(nèi)含子的剪接，但也是核酶的活性之一）

除核酶之外，核酸酶和由內(nèi)含子本身編碼的成熟酶也參與某些內(nèi)含子的剪切，如真核tRNA內(nèi)含子和酵母cob基因的內(nèi)含子的2的剪接。56精選課件ppt2.RNA中的內(nèi)含子基因長度/kb內(nèi)含子數(shù)量內(nèi)含子所占比例/%胰島素1.4267球蛋白1.4269血清蛋白181389膠原蛋白組分Ⅶ3111771Ⅷ因子1862595萎縮性肌強直因子240078＞99部分人類基因中，內(nèi)含子序列所占比重的分析57精選課件ppt內(nèi)含子去除、RNA的剪接基本方式：在高等真核生物，核RNA內(nèi)含子的去除由剪接裝置(splicingapparatus)完成，在外顯子和內(nèi)含子交界處和內(nèi)含子內(nèi)部有可供識別的特異序列，剪接裝置由多種蛋白質(zhì)和核蛋白組成；有兩類內(nèi)含子的去除屬自剪接，具有中部核心結(jié)構(gòu)，形成特定的二級結(jié)構(gòu)，RNA具有催化剪接的作用；酵母tRNA的剪接需要蛋白質(zhì)酶的參與，該酶與tRNA后加工過程中的酶有相似之處。除tRNA的剪接之外，其他RNA的剪接盡管參與反應(yīng)的要素不同，但都屬于轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。58精選課件ppt2.1內(nèi)含子的邊界順序及類型內(nèi)含子的邊界順序由保守的基序組成比較大量的真核生物mRNA內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)，它們的兩側(cè)邊界均有一對保守順序，即5'-端為GU，3'-端為AG，這類稱為GU

AG的內(nèi)含子均以相同方式剪切。59精選課件ppt60精選課件ppt在不同的真核生物中，內(nèi)含子的一致順序有不少變化，動物中典型的剪接位置一致順序組成為：

5'

AG

GUAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAG

3'

其中Y為U或C，N為任何核苷酸，箭頭所指為外顯子與內(nèi)含子的交界。5’端剪接位稱供體位（donorsite），3’端剪接位稱受體位（acceptorsite）。僅僅GU

AG邊界順序并不能保證內(nèi)含子的正確剪切，因為在內(nèi)含子中有不少相同的GU

AG順序。內(nèi)含子中還有另一段識別剪接邊界必不可少的序列稱為分枝點，位于3‘-端剪接位的上游，具有特征性組成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接時參與形成分枝的特別位點。緊接在分枝點的下游有一段多嘧啶序列，也是參與剪接事件蛋白接合的位置。酵母中分枝點序列為5’

UACUAAC

3‘，位于3’剪接位上游18到140bp之間，其作用不同于高等真核生物。61精選課件ppt類型分布GU-AG內(nèi)含子真核生物細(xì)胞核前體mRNAAU-AC內(nèi)含子真核生物細(xì)胞核前體mRNAI型（GroupⅠ）內(nèi)含子真核生物細(xì)胞核前體rRNA細(xì)胞器RNA,少數(shù)細(xì)菌RNAII型（GroupⅡ）內(nèi)含子細(xì)胞器RNA，某些原核RNAIII型（Group

Ⅲ）內(nèi)含子細(xì)胞器RNA雙內(nèi)含子（Twintron）細(xì)胞器RNA前體tRNA內(nèi)含子真核生物細(xì)胞核前體tRNA古細(xì)菌內(nèi)含子不同的RNA2.2內(nèi)含子的類型62精選課件ppt63精選課件ppt3、RNA的剪切3.1mRNA前體的剪切3.1.1核內(nèi)小RNA3.1.2RNA的剪切過程3.2Ⅰ類內(nèi)含子剪切3.3Ⅱ類內(nèi)含子剪切3.4順式剪切與反式剪切64精選課件ppt3.1.1核內(nèi)小RNA3.1.2RNA的剪切過程3.1mRNA前體的剪切65精選課件ppt3.1.1剪接要求snRNAs的參與在高等生物中都含有很多不連接的小分子RNA片段，限制在核內(nèi)的稱為小分子核內(nèi)RNA(smallnuclearRNAs，snRNAs)。在細(xì)胞質(zhì)的稱為小分子胞質(zhì)內(nèi)RNA（smallcytoplasmic

RNAs，scRNA)在自然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白（RNP）的形式存在。剪接裝置中的snRNPs和大量的附加蛋白，常稱為剪接因子。66精選課件ppt在剪接過程中有5種snRNAs(smallnuclearRNAs)參加，它們是U1、U2、U5、U4、和U6。5種snRNAs+proteins→ThesnRNPs→splicesome67精選課件pptU1snRNA

堿基互補配對方式識別mRNA前體5‘剪切點U2輔助因子

與3’剪切點上游的富嘧啶區(qū)結(jié)合識別mRNA前體3‘剪切點U2snRNP

與分支點結(jié)合U2snRNA

剪切前體

60S剪切體spliceosome

U4、U5、U6

snRNP三聚體68精選課件pptU1snRNA自我配對形成了多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成了不同的功能區(qū)。Sm結(jié)合位點是和其他snRNP相互作用的區(qū)域。其5’端有一保守序列：

3’-CAUUCAU-5’這一序列可與核mRNA內(nèi)含子5’端的邊界序列互補結(jié)合，這對于剪接反應(yīng)是很重要的。69精選課件pptU2與分枝點配對；U6與mRNA5’端配對U5使兩個外顯子靠攏70精選課件pptU6snRNA既能與U4配對也能與U2配對71精選課件ppt3.1.2核mRNA的剪接核mRNA的剪接過程和Ⅱ類內(nèi)含子十分相似，根本區(qū)別是：核mRNA前體本身不能形成二級結(jié)構(gòu)，必需依賴于snRNP(U1,U2,U4,U5和U6)的幫助才能形成剪接體，進行自我剪接。結(jié)構(gòu)特點：邊界順序完全符合GU-AG法則含分枝點序列

內(nèi)含子5’端保守序列（5’GUAAGUA3’）

和U1snRNA的5’端保守序列3’CAUUCAU5’互補

72精選課件ppt剪接機制73精選課件ppt在剪接體的作用下通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)而完成形成一個套索（lariat）結(jié)構(gòu)和剪接了的外顯子snRNP的剪接功能和反應(yīng)步驟是：U1結(jié)合→形成Ecomplex（下頁圖）→Acomplex(U2結(jié)合)→B1complex

→B2complex→C1complex→C2complex74精選課件pptThefirstcomplexformedduringsplicingistheE(earlypresplicing)complex,whichcontainsU1snRNP,thesplicingfactorU2AF,andmembersofafamilycalledSRproteins,whichcompriseanimportantgroupofsplicingfactorsandregulators.75精選課件pptu1u2u5u4u6u1u4u5u4u6u2u5u5u2u6u1u1u2u2u2u6Ecomplex+U2Acomplex(U2與分枝位結(jié)合)B1complex(U5/U4/U6三聚體結(jié)合，U5結(jié)合在外顯子5’端，U6與U2結(jié)合)B2complex(釋放出U1,U5從外顯子向內(nèi)含子移動，U6結(jié)合在5’剪接位點)C1complex(釋放出U4,U6/U4催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，U5結(jié)合在外顯子3’剪接位點.5’位點被切開，形成套索)C2complex(U2/U5/U6仍結(jié)合在套索上。3’位點被切開，外顯子被連接)釋放出剪接了的RNA,套索脫分枝成線狀?！?6精選課件ppt77精選課件ppt78精選課件ppt播放動畫mRNAsplicing.mov

79精選課件ppt3.2Ⅰ類內(nèi)含子及其剪接1.發(fā)現(xiàn)

Cechetal.1981研究四膜蟲（Tetrahymenathermophila）35S的前體rRNA（含有413nt的內(nèi)含子）↓

在體外能夠進行自我剪接80精選課件ppt2.分布

Ⅰ類內(nèi)含子常分布于低等真核生物的細(xì)胞器中，如四膜蟲的rRNA；大部分真菌如酵母的mtDNA；植物葉綠體基因的內(nèi)含子；T4噬菌體的3個基因中也存在Ⅰ類內(nèi)含子3.結(jié)構(gòu)特點

邊界序列為5’U——G3’

內(nèi)含子中有中部核心結(jié)構(gòu)(centralcorestucture)

內(nèi)部引導(dǎo)序列（internalguidesequenece,IGS）81精選課件pptⅠ類內(nèi)含子有一個共同的二級結(jié)構(gòu)，共9個配對區(qū)（P1—P9），其中P4和P7是Ⅰ類內(nèi)含子中共有的保守序列。P4由P和Q序列形成，長10nt，配對堿基6－7對。P7由R和S序列構(gòu)成，長12nt，5對堿基配對。P3,P4,P6和P7是核心結(jié)構(gòu)，是可以執(zhí)行催化的最小區(qū)域。其他的配對區(qū)在不同的內(nèi)含子中是不同的。IGS82精選課件ppt內(nèi)部引導(dǎo)序列（internalguidesequenece,IGS）：1982年由Davies提出，由6個nt組成，GGAGGG（四膜蟲）。內(nèi)含子中可與外顯子配對的序列稱為內(nèi)部引導(dǎo)區(qū)。最初認(rèn)為IGS的作用是通過和兩個外顯子近側(cè)區(qū)配對，使外顯子并在一起，現(xiàn)在認(rèn)為其作用是決定剪接的專一性。

83精選課件pptⅠ類內(nèi)含子的剪接機制

自剪接（self-splicing）反應(yīng)，通過3次連續(xù)的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成。只是磷酸酯鍵的直接轉(zhuǎn)移，沒有水解，不需能量。84精選課件ppt特點：由于內(nèi)含子自身形成特定的二級三級結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生適于剪接反應(yīng)的空間構(gòu)象和活性位點，相當(dāng)于傳統(tǒng)酶的激活位點，即G苷酸結(jié)合位點和底物結(jié)合位點，后者依賴于IGS的配對來確定。G的參與完成剪接反應(yīng)。即剪接反應(yīng)完全由內(nèi)含子自身完成。85精選課件ppt86精選課件ppt87精選課件ppt88精選課件ppt89精選課件ppt90精選課件ppt3.3Ⅱ類內(nèi)含子的剪接Ⅱ類內(nèi)含子的剪接和Ⅰ類內(nèi)含子不同，而和核mRNA內(nèi)含子的剪切有些相似。分布：在酵母mtRNA,細(xì)胞色素氧化酶的a亞基、b亞基，玉米mtRNA、tRNA以及真核mRNA前體中。邊界序列為5’↓GUGCG---YnAG↓,符合GT—AG法則91精選課件ppt

Ⅱ類內(nèi)含子的二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)：形成6個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使兩個并列的功能區(qū)靠近。功能區(qū)5和功能區(qū)6被兩個堿基隔開。功能區(qū)6含有1個不配對A殘基，其上帶有2－OH,發(fā)動第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。

92精選課件ppt與前所敘的核基因mRNA的剪接過程相比，Ⅱ類內(nèi)含子的最大特定是不需要其他成分的參與，RNA分子本身能形成剪接所需的空間結(jié)構(gòu)和催化活性區(qū)域。在核基因mRNA的剪接過程中，需要多種成分特別是snRNA與RNA前體共同作用才能形成剪接所需的空間結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生具催化功能的區(qū)域。93精選課件pptⅡ類內(nèi)含子的剪接機制94精選課件pptDNA(promoter)→RNA(splicing)→Proteins95精選課件ppt3.4順式剪切與反式剪接

3.4.1順式剪接（cis-splicing）內(nèi)含子的剪接一般都是發(fā)生在同一個基因內(nèi)，切除內(nèi)含子，相鄰的外顯子彼此連接，稱為順式剪接。對很多基因而言，RNA剪接是一個不變的加工過程?；蜣D(zhuǎn)錄時所有細(xì)胞中產(chǎn)生同樣的成熟轉(zhuǎn)錄本及單種產(chǎn)物。這稱為組成型剪接(constructivesplicing)。

其他一些基因，RNA剪接可以作為基因調(diào)節(jié)的機制，也就是說在兩種組織中同一基因表達不同，盡管它以相同的方式和速度轉(zhuǎn)錄。這樣的調(diào)節(jié)以兩種方式發(fā)生。96精選課件ppt

第一種情況:

加工或去除調(diào)節(jié)(processingordiscardregulation)，初始轉(zhuǎn)錄本在一些組織中加工，在其他組織中不剪接。在有些低等真核生物中(如海膽)，這是主要調(diào)節(jié)機制。大部分基因在大部分組織中轉(zhuǎn)錄，由RNA加工調(diào)節(jié)來決定那些基因被翻譯。在果蠅中，一個類似的機制用來控制P因子轉(zhuǎn)座酶(參閱)的合成，在這種情況下雖然只有一個內(nèi)含子未被剪接，但卻限制了P因子轉(zhuǎn)座只發(fā)生在生殖細(xì)胞中。轉(zhuǎn)座酶基因包含三個內(nèi)含子，在生殖細(xì)胞中產(chǎn)生成熟的編碼轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)錄本，然而在其他組織中，第三個含終止密碼子的內(nèi)含子被保留，使轉(zhuǎn)座酶蛋白截短，從而阻止體細(xì)胞中P因子的轉(zhuǎn)座。內(nèi)源性基因也用同樣的策略，如哺乳動物GABAA受體E亞基的mRNA前體除了腦以外其他組織都不剪接。

97精選課件ppt第二種情況:

差別或選擇性剪接(differentialalternativesplicing)基本轉(zhuǎn)錄體通過選擇使用外顯子以不同方式加工相關(guān)成熟轉(zhuǎn)錄體家族產(chǎn)生不同基因產(chǎn)物，稱為剪接變異體(splicevariants)或剪接異構(gòu)體(spliceisoforms)。98精選課件ppt可變剪接產(chǎn)生多種RNA99精選課件ppt100精選課件ppt選擇性剪接以多種方式進行：

1）利用不同的外顯子由于不同細(xì)胞類型有著不同修飾的反式因子，導(dǎo)致利用不同的外顯子。例如動物細(xì)胞的原肌球蛋白(atropomyosin)

基因有13個外顯子。101精選課件ppt2)兩個相互排斥的外顯子的剪接

有兩類外顯子對，每對之中只有一個成員能剪接到成熟的mRNA中，看來像是相互排斥似的。降鈣素(calcitonin)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningenerelatedpeptide，CGRP)分別利用相鄰的兩個外顯子，得到的兩種產(chǎn)物分別為甲狀腺和神經(jīng)元細(xì)胞中所特有。

102精選課件ppt(3)半個起始位點，多個加poly(A)位點

一些真核病毒轉(zhuǎn)錄物存在多至5個這樣的位點(Tsurshital988)。對于一個有兩個加poly(A)位點的轉(zhuǎn)錄物，大多數(shù)細(xì)胞類型通過利用內(nèi)側(cè)的位點產(chǎn)生分泌型的蛋白，一些分化的細(xì)胞類型犀其產(chǎn)物是膜蛋白的轉(zhuǎn)錄物，則利用外側(cè)的位點產(chǎn)生具有膜錨序列的膜結(jié)合蛋白。還是用降鈣素和CGRP的例子，前者利用內(nèi)側(cè)的加poly(A)位點，后者則利用外側(cè)的?？赡艽嬖谀撤N細(xì)胞類型特異的反式激活因子提高外側(cè)位點的利用效率。103精選課件ppt(4)多個5’剪接位點競爭同一3’剪接位點有一些基因含有多個5’剪接位點，它們的選擇依賴于5’剪接位點的強度(高度適配者強)、與3’剪接位點的接近程度、空間限制等因素之間的平衡。在大多數(shù)細(xì)胞類型中將選擇上游的5’剪接位點，而使處于下游的5’剪接位點無效，主要是因為后者與分叉點的距離一般太近而不利于建立剪接體之故(Noblel988)。也有的分別利用不同的5’剪接位點，得到不同的產(chǎn)物。104精選課件ppt(5)內(nèi)含子保留和框式外顯子

有的情況下，一個內(nèi)含子不被剪接而保留下來，如果維持可讀框架，便是一個多肽片段的插入；如果移格，便會產(chǎn)生功能不同的產(chǎn)物或者關(guān)掉基因的表達。所謂盒式外顯子是指那些與其他鄰近的外顯子的剪接無關(guān)而獨立剪接的外顯子。當(dāng)幾個盒式外顯子存在于同一個轉(zhuǎn)錄物中，其產(chǎn)物會產(chǎn)生高度的趨異，如一個基因含有5個盒式外顯子，再加上一對相互排斥的外顯子，在理論上可以生64種同工型多肽。真核基因存在5個以上的外顯子是常有的，甚至多達37個外顯子，由此產(chǎn)生蛋白質(zhì)的多樣性是十分豐富的。105精選課件ppt肌鈣蛋白T有13個外顯子，編碼259個氨基酸殘基，然而此蛋白的長度在體內(nèi)不同部位的肌肉中是不同的。有11個外顯子(黑框)是所有mRNA都有的；外顯子4—8(白框)則可自由組合(4、6、8，4、7、8，7、8等等)，共有32種可能性；外顯子16和17(灰框)是相互排斥的，兩者只能有一個出現(xiàn)在成熟的蛋白質(zhì)中。這樣，總共就有64種可能的mRNA。106精選課件ppt(6)非剪接位點的序列參與調(diào)節(jié)

一些真核生物的病毒RNA其初級轉(zhuǎn)錄物即使有正確的功能剪接位點，有時也會有一部分甚至大部分不發(fā)生剪接(ArrigoandBeemon1988)。這是由于其內(nèi)含子中存在一種負(fù)調(diào)節(jié)元件使剪接無效，也有的基因在外顯子中存在一些促進和抑制剪接的序列。107精選課件ppt返回返回返回108精選課件ppt順式剪接機理：109精選課件ppt

U群snRNA+多肽→snRNPU群snRNA是一群豐富的小分子RNA,其序列進化上相對保守，但通過轉(zhuǎn)錄后堿基修飾會導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)的改變，因而構(gòu)成不同功能的snRNP,使之識別和競爭不同的剪接位點。剪接體/拼接體的裝配：1、U1snRNP與5’剪接位點結(jié)合2、U2snRNP與分枝點結(jié)合3、U4/U6和U5snRNP結(jié)合上4、最后形成剪接體，U5既與5’剪接位點也與3’剪接位點結(jié)合。110精選課件ppt

參加剪接反應(yīng)的蛋白質(zhì)因子有兩種類型：

一類結(jié)合在UsnRNA上形成snRNP復(fù)合物，例如Sm蛋白，共同地與U1、U2、U5snRNA緊密結(jié)合；U1snRNP中有3種而U5snRNP有7種蛋白緊密地與之特異結(jié)合。另外，還有一些蛋白暫時地與snRNP組分相互作用并起著特殊的作用，它們是一些RNA依賴的ATPase和螺旋酶，如酵母的PRP24促進U4—U6復(fù)合物的形成，PRP4通過蛋白—蛋白相互作用結(jié)合U4—U6snRNP和U5snRNP形成上述的三元snRNP復(fù)合物；PRP8與U5snRNP結(jié)合并和3’剪接位點相互作用。這些蛋白的一部分基序結(jié)合到RNA上，另一部分結(jié)合到蛋白質(zhì)上形成蛋白“橋”，介導(dǎo)RNA-RNA相互作用，以及剪接體構(gòu)象改變，通過決定構(gòu)象改變的計時來影響剪接。

111精選課件ppt另一類是一些結(jié)構(gòu)相關(guān)進化上保守的蛋白質(zhì)因子，稱之為SR(SRP)家族。已發(fā)現(xiàn)此家族的成員有SRP20、SRP30a、(SF2／ASF)、SRP30b(PR264／SC35)、SRP40、SRP55、SRP70～75(數(shù)字表示分子質(zhì)量，kDa)，這些蛋白的N端有一個共同的基序(RRM或RBD)識別和結(jié)合RNA；其C端長度變化，由交替的絲氨酸和精氨酸殘基組成的結(jié)構(gòu)域可能和結(jié)合特異性有關(guān)。這些蛋白在剪接過程早期起著幫助前mRNA投入剪接，后期護送snRNP加入剪接體，在剪接的兩步反應(yīng)中一直與剪接體締合。由于這些蛋白因子的表達量是組織特異的，而它們存在的量和剪接位點的選擇又相關(guān)，因而不同的SRP蛋白對不同的剪接位點的優(yōu)先利用表現(xiàn)為一種組織特異性。SRP蛋白在離體剪接中都表現(xiàn)出活性的互補，但不同的SRP蛋白有其保守性，又說明每種SRP蛋白應(yīng)有其不同的功能。112精選課件ppt

3.4.2反式剪接(trans—splicing)

前面討論的剪接過程都是發(fā)生在一個RNA分子內(nèi)部，即通過剪接將一個RNA分子內(nèi)的內(nèi)含子剪掉，使外顯子連接在一起——順式剪接(cis-splicing)。但也有另外一種情況，即不同基因的外顯子剪接后相互連接，此稱為反式剪接（trans-splicing）已發(fā)現(xiàn)，在錐蟲、線蟲以及植物的葉綠體中發(fā)生兩個RNA分子之間的剪接，即反式剪接。

113精選課件ppt114精選課件ppt

反式剪接是以兩種不同來源的RNA前體分子作為底物。反式剪接的5’端外顯子稱為剪接前導(dǎo)RNA(splicedleaderRNA，SLRNA)。經(jīng)過剪接在成熟的mRNA非翻譯部分5’端剪接上一小段稱為“剪接前導(dǎo)序列(splicedleader，SL)”或“小外顯子(mini-exon)”的RNA片段。

這些片段本來并不存在于相應(yīng)的編碼基因前面，而是由其他DNA鏈轉(zhuǎn)錄而來。已發(fā)現(xiàn)的各種SLRNA有一些共同的特點：都折疊成一種相同的二級結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)有3個莖—環(huán)(stem-loop)和一個單鏈區(qū)，此單鏈區(qū)類似于U1的Sm結(jié)合位點。因此，SLRNAs存在和snRNPs相似的形式。115精選課件ppt116精選課件ppt117精選課件ppt118精選課件ppt4RNA的編輯和修飾4.1RNA編輯（RNAediting）某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變，因為經(jīng)過編輯的mRNA序列發(fā)生了不同于模板DNA的變化。

單堿基突變尿苷酸的缺失和添加

119精選課件ppt載脂蛋白B基因有29個外顯子第2153位密碼子CAA編碼谷氨酰胺CAAUAA肝中剪切的mRNA編碼4563個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)腸mRNA因UAA密碼子在2153位密碼子終止合成120精選課件ppt4.2RNA修飾某些RNA，特別是前體rRNA和tRNA還可能有異性化學(xué)修飾。121精選課件ppt本次內(nèi)容